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中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的microRNA应答分析   总被引:3,自引:0,他引:3  
【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种能够侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,miRNA)可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程。本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA(DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,进而揭示DEmiRNA在中蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用。【方法】利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行测序,通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因。通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库。利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNA的调控网络。通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】本研究共预测出537个miRNA,其长度分布介于16–35 nt之间,且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显。通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达。AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA,包含31个上调和23个下调miRNA,可分别靶向结合6170和8199个靶基因。GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目,富集基因数最多的皆为结合细胞进程和催化活性。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway,富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工。调控网络分析结果表明,DEmiRNA及其靶mRNA形成十分复杂的调控关系;31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNA,18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNA;miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控。最后,随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证,结果证明了测序数据的可靠性。【结论】本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作。miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御,miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答。本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标。  相似文献   
2.
本研究旨在基于已获得的第三代纳米孔全长转录组数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae基因的可变剪接(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行分析。通过Astalavista软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫基因的AS事件类型。采用TAPIS pipeline对东方蜜蜂微孢子虫基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析所有全长转录本的poly (A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif。共鉴定出发生于5个基因的5次AS事件,包括1次可变供体位点(alternative donor site,ADS)和4次内含子保留(intron retention,IR)。鉴定出233个基因发生APA,其中含有1个poly (A)剪接位点的基因数量最多(143,61.37%)。序列特征分析结果显示,东方蜜蜂微孢子虫全长转录本的3’ UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U在3’ UTR的上游富集,而A在3’ UTR的下游富集。此外,在东方蜜蜂微孢子虫全长转录本的poly (A)剪接位点上游鉴定到3个motif(AAUAAA、UGAUGC和GCGACG)。研究结果揭示了东方蜜蜂微孢子虫转录组的复杂性,完善了现有的参考基因组和转录组注释,也为深入探究不同剪接异构体的分子功能提供了基础。此外,本研究为其他真菌的AS和APA研究提供了有益的思路和方法借鉴。  相似文献   
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4.
【目的】本研究拟利用已获得的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝的PacBio单分子实时(single molecule real-time, SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)和插入缺失(insertion-deletion, InDel)突变位点进行发掘和分析,旨在丰富蜜蜂球囊菌的SNP和InDel位点信息,并为新型分子标记的开发和应用提供基础。【方法】采用SAMtools对蜜蜂球囊菌菌丝PacBio SMRT测序数据进行全长转录本识别,再利用ANNOVAR软件将识别的全长转录本与蜜蜂球囊菌参考基因组(assembly AAP 1.0)进行比对以检测和分析SNP位点和InDel位点。通过相关生物信息学软件将上述SNP位点和InDel位点基因分别比对GO和KEGG数据库进行功能和通路注释。【结果】在蜜蜂球囊菌菌丝中共鉴定到6 743个SNP位点,主要分布于外显子,包括6 091个纯合位点和652个杂合位点;其中发生转换和颠换的SNP位点分别有4 887和1 856个;SNP位点密码子突变类...  相似文献   
5.
[目的] 本研究旨在探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)6日龄幼虫应答蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)侵染过程中的差异表达谱及调控作用。[方法] 利用链特异性cDNA建库的RNA-seq技术对未被侵染及球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行深度测序。通过相关生物信息学软件分析lncRNA的结构特征和表达谱。筛选并分析差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA)的顺式(cis)作用及竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络。采用RT-qPCR验证测序数据及DElncRNA差异变化趋势的可靠性。[结果] AcCK和AcT共预测出642个已知lncRNA和487个新lncRNA。与蛋白编码基因相比,上述中蜂lncRNA外显子数更少、长度更短且表达量更低。43个antisense lncRNA与40个正义链mRNA之间互补配对。AcCK和AcT比较组包含367个上调lncRNA和268个下调lncRNA。有194个DElncRNA潜在调控461个上下游基因,并涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等38个功能条目以及氨基酸代谢、内吞作用和MAPK等191条通路。此外,有180个DElncRNA可靶向结合50个DEmiRNA,进而调控6365个mRNA;三者之间形成较为复杂的ceRNA调控网络。[结论] 中蜂6日龄幼虫肠道的部分lncRNA可作为antisense lncRNA参与应答球囊菌侵染;部分DElncRNA可通过cis作用调节物质代谢和免疫途径相关的上下游基因,从而介导宿主的侵染应答;TCONS_00010661和TCONS_00003104等DElncRNA可通过ceRNA网络调控Jak-STAT和氧化磷酸化等通路及富集基因,进而参与宿主的侵染应答。  相似文献   
6.
[目的]蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis是一种专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病的致死性真菌病原.基于前期已获得的高质量纳米孔(Nanopore)长读段测序数据,对蜜蜂球囊菌菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的毒力因子相关全长转录本进行鉴定和分析,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供参考信息和基础.[方法]利用BLAST工具,将AaM和AaS中的所有全长转录本比对Nr数据库,以鉴定蜜蜂球囊菌的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的全长转录本.使用minimap2软件,将AaM和AaS中的全长转录本序列与蜜蜂球囊菌参考基因组注释的已知转录本序列进行比对,将比对到参考基因组的全长转录本进行归一化处理,再通过每百万计数法(Counts per million,CPM)计算毒力因子相关全长转录本的表达量.利用百迈克云平台的相关工具绘制转录本的表达量聚类热图.通过IGV浏览器对部分毒力因子相关全长转录本结构进行可视化.[结果]在AaM鉴定到毒力因子相关的367个基因及407个全长转录本,包括12条几丁质酶相关全长转录本,48条脂肪酶相关全长转录本,289条水解酶相关全长转录本,58条蛋白酶相关全长转录本.在AaS鉴定到毒力因子相关367个基因及400个全长转录本,包括14条几丁质酶相关全长转录本,63条脂肪酶相关全长转录本,267条水解酶相关全长转录本,56条蛋白酶相关全长转录本.另外,AaM和AaS特有的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶)相关全长转录本分别有0条和17条,共有的毒力因子相关全长转录本有60条.进一步分析发现,蜜蜂球囊菌的部分毒力因子基因可通过可变剪接形成多条剪接异构体.[结论]共鉴定到蜜蜂球囊菌毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的367个基因和486条全长转录本;相比于蜜蜂球囊菌参考基因组注释的转录本,绝大多数毒力因子基因对应的全长转录本数量更多且结构更为复杂.研究结果丰富了蜜蜂球囊菌毒力因子相关基因和转录本的注释信息,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供了基础,也为白垩病防控提供了潜在靶点.  相似文献   
7.
【目的】意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica是生产性能优良的西方蜜蜂Apis mellifera亚种。本研究旨在利用分子生物学手段揭示3种微小RNA(microRNA, miRNA) ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam调控蛹期变态发育的分子机理。【方法】通过stem-loop RT-PCR验证ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹期的真实表达。通过RT-qPCR检测ame-miR-13b, ame-miR-100, ame-miR-bantam和靶mRNA在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程的表达谱。利用相关生物信息学软件预测在意大利蜜蜂工蜂蛹期ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam的靶mRNA,构建和分析miRNA-mRNA调控网络以及对靶mRNA进行数据库注释。【结果】ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程真实表达且表达量总体均呈动态上升趋势;可分别靶向850, 136和506条mRNA,并与其靶mRNA之间形成较复杂的调控网络;这些靶mRNA可分别被注释到32, 24和33个GO条目,以及204, 114和171条KEGG通路。【结论】ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam潜在通过调控蜕皮激素基因、yellow基因以及Hippo, FoxO, Wnt, Jak-STAT和Notch信号通路相关基因的表达共同影响意大利蜜蜂工蜂蛹期的变态发育过程。  相似文献   
8.
【目的】Piwi蛋白互作RNA(PIWI-interacting RNA, piRNA)在昆虫的发育和免疫等重要生物学过程发挥重要的调控作用。本研究旨在丰富西方蜜蜂Apis mellifera的piRNA信息,并为进一步探究差异表达piRNA(differentially expressed piRNA, DEpiRNA)调控意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠发育的分子机理提供基础。【方法】基于已获得的意大利蜜蜂7日龄(Am7)和10日龄(Am10)工蜂中肠的small RNA(sRNA)组学数据,对piRNA进行预测和分析。将质控后的sRNA数据比对西方蜜蜂参考基因组,再将比对上的序列标签(tags)进一步比对数据库以滤除rRNA和tRNA等小非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),进而根据piRNA的长度特征鉴定piRNA。采用TPM(tags per million)算法对piRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log2 fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选Am7 vs Am10 比较组的DEpiRNA。通过相关软件预测DEpiRNA的靶mRNA并进行GO和KEGG数据库注释。利用Cytoscape软件对DEpiRNA-mRNA调控网络进行可视化。通过Stem-loop RT-PCR对随机选取的Am7与Am10两组共有的6个piRNA的表达进行验证。利用RT-qPCR对随机挑选的6个DEpiRNA的表达趋势进行验证。【结果】从意大利蜜蜂工蜂中肠中共鉴定到596个piRNA,长度介于24~33 nt,且Am7和Am10组中不同长度分布范围的piRNA的首位碱基偏向性具有明显差异。在Am7 vs Am10比较组共筛选出41个DEpiRNA,其中piR-ame-11093, piR-ame-1111451,piR-ame-190949和piR-ame-932156可分别靶向1 195, 1 018, 4 040和1 063条mRNA。上述靶mRNA可分别注释到45个功能条目和45条通路。Stem-loop RT-PCR验证结果显示6个piRNA(piR-ame-1084826, piR-ame-11093, piR-ame-14476, piR-ame-24995, piR-ame-39500和piR-ame-774987)均真实表达。RT-qPCR结果显示共有6个DEpiRNA (piR-ame-1084826,piR-ame-11093, piR-ame-14476, piR-ame-24995, piR-ame-39500和piR-ame-774987)的表达趋势与测序数据中的表达趋势一致,证实了本研究中sRNA-seq数据的可靠性和piRNA差异表达趋势的真实性。【结论】本研究从意大利蜜蜂工蜂中肠中鉴定到596个piRN,长度介于24~33 nt。不同长度分布范围的piRNA的首位碱基偏向性具有明显差异;piR-ame-11093, piR-ame-1111451,piR-ame-190949和piR-ame-932156具有靶向调控基因表达参与工蜂中肠发育过程的潜力。  相似文献   
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【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,导致的白垩病是严重影响养蜂生产的顽疾,每年给养蜂业造成较大损失。本研究旨在基于已获得的第三代长读段测序数据对球囊菌菌丝(Aam)和孢子(Aas)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行深入分析。【方法】利用Astalavista软件鉴定Aam和Aas中基因的AS事件类型。利用IGV浏览器对部分剪切异构体(isoform)的结构进行可视化。通过TAPIS pipeline对Aam和Aas中基因的APA位点进行鉴定。通过MEME软件对Aam和Aas中全长转录本的APA位点上游50bp的序列特征进行分析并对motif进行鉴定。【结果】在Aam中共鉴定到286次AS事件,包括162次RI(Retained intron),87次A3(Alternative 3'splice-site)、32次A5(Alternative 5'splice-site)和5次SE (Skipping exon);在Aas中共鉴定到559次AS事件,包括305次RI、155次A3、85次A5、13次SE和1次MEE (Mutually exclusive exon)。进一步分析发现,现有参考基因组上的多数注释基因结构并不完整;部分注释基因在菌丝和孢子中转录形成的isoform在数量和结构方面均存在差异;部分isoform在参考基因组中没有对应的注释基因。Aam中共鉴定到2748个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有1个APA位点的基因数量最多(726,26.42%);Aas中共鉴定到2768个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有5个以上APA位点的基因数量最多(1180,42.63%)。部分基因在菌丝和孢子中含有不同的APA位点数。序列特征分析结果显示,球囊菌全长转录本的3'UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U和A分别富集在3'UTR的上游和下游。此外,在球囊菌全长转录本的APA位点上游鉴定到4个motif,分别是UCUCCU、UCUUCU、CCCACC和CCCCCU。【结论】本研究通过对球囊菌菌丝和孢子中基因的AS和APA进行深入分析,揭示了球囊菌转录组的复杂性,为完善现有的基因组和转录组注释提供了宝贵信息,也为探究AS和APA在球囊菌的基因表达调控中的作用提供了关键基础。  相似文献   
10.
【目的】微小RNA(microRNAs, miRNAs)在昆虫的繁殖、发育和免疫等重要生命活动的调控过程中扮演关键角色。本研究旨在探究在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫个体水平过表达与敲减ame-miR-13b对其靶基因表达的影响,为深入探究ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ame-miR-13b的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-ame-miR-13b和抑制物inhibitor-ame-miR-13b及其对照mimic-NC和inhibitor-NC,混入饲料后饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫,每12 h更换一次饲料,连续饲喂6次,以分别过表达和敲减ame-miR-13b;通过RT-qPCR检测过表达和敲减ame-miR-13b后意大利蜜蜂幼虫肠道中ame-miR-13b及其靶基因Ecr, Egfr和P450 18a1的表达量。【结果】与mimic-NC饲喂组相比, mimic-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在意大利蜜蜂4和6日龄幼虫肠道中均显著上调表达;与饲喂inhibitor-NC组相比,inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在4日龄幼虫肠道中下调表达,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调表达。与mimic-NC饲喂组相比,过表达ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr的表达量显著降低,而Ecr和P450 18a1的表达量均显著升高。与inhibitor-NC饲喂组相比,敲减ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr上调表达但不显著,Ecr显著上调表达,而P450 18a1显著下调表达。【结论】通过饲喂法在意大利蜜蜂幼虫个体中成功实现了miRNA的过表达和敲减;ame-miR-13b与Egfr之间存在潜在的负调控关系。  相似文献   
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