钝齿棒杆菌argR基因缺失株构建及其缺失对精氨酸生物合成途径相关基因转录水平的影响

[目的]钝齿棒杆菌AS 1.542中argR基因编码的蛋白ArgR在精氨酸生物合成途径中扮演负调控的角色,但其对相关基因在转录水平的影响还未见报道.因此,本课题组构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并在转录水平上比较野生株与缺失株精氨酸生物合成途径相关基因的变化.[方法]采用无痕敲除的方法构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并采用荧光定量PCR方法分析缺失株和野生株精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化.[结果]利用pK18mobsacB质粒中蔗糖致死基因sacB反向筛选标记及PCR方法成功筛选到钝齿棒杆菌argR基因缺失株;荧光定量PCR结果表明,argR基因缺失株精氨酸生物合成途径中相关基因在转录水平获得大量提高,平均约上调162.13倍.[结论]钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径的相关基因受负调控蛋白ArgR的显著调控,但其基因的敲除并没有引起精氨酸产量发生明显的变化.     

proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

为了选育精氨酸高产菌株,基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过基因敲除技术构建了pro C和put P敲除菌株。摇瓶发酵结果表明,pro C敲除菌株精氨酸产量达到9.94g/L,较出发菌株提高了15.90%,葡萄糖转化率提高了26.02%。由于其生长受到明显抑制,因此在发酵液中外源添加24mmol/L的脯氨酸,结果发现其精氨酸产量达到12.22g/L,且菌株恢复生长。put P敲除菌株精氨酸产量达到12.23g/L,较出发菌株提高了42.70%,葡萄糖转化率提高了49.31%。以上结果显示,put P的敲除比pro C的敲除更有利于精氨酸的合成,put P的敲除对菌株的生理代谢基本无影响且无需外添加脯氨酸。     

L-鸟氨酸发酵菌种的代谢工程研究进展

L-鸟氨酸是一种非蛋白类氨基酸参与尿素代谢及生物多胺类的合成,其对人体具有治疗肝脏疾病、增强免疫力等作用,被广泛应用于医疗、保健、食品等领域。工业上生产鸟氨酸主要有化学法、酶法及工业发酵法。其中,发酵法因其生产成本及环境保护等方面的优势而逐渐成为研究的焦点。本文归纳了近年来采用基因工程技术选育鸟氨酸高产菌种最新研究进展,重点讨论了产鸟氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造策略,并对未来的研究方向进行了预测。     

蛋白质赖氨酸残基的琥珀酰化修饰

蛋白质的琥珀酰化修饰是一种普遍存在于真核生物和原核生物中的翻译后修饰。修饰的蛋白质遍及细胞膜、细胞质基质、各种细胞器及细胞核等细胞的各个部分,它们参与了细胞内包括糖代谢、三羧酸循环和脂肪酸代谢等各种代谢反应,与生命体的活动息息相关。本文综述了琥珀酰化蛋白质活性变化、修饰位点周围氨基酸的特异性及空间结构的分析、亚细胞分布情况、琥珀酰化与乙酰化之间的相互作用及碳源和生长阶段对蛋白质琥珀酰化水平的影响等内容,以期为后续蛋白质的琥珀酰化科研提供一定的参考。     

钝齿棒杆菌FarR对精氨酸生物合成基因簇转录水平的影响及其与ArgR的关系

【目的】FarR蛋白可参与棒杆菌精氨酸生物合成途径中相关基因的调控,但具体机制不清楚。本研究通过比较钝齿棒杆菌farR、argR单敲除株和farR与argR双敲除株Arg生物合成途径中相关基因转录水平的变化来揭示FarR蛋白功能及其与ArgR的内在关联性。【方法】采用无痕敲除方法构建了钝齿棒杆菌farR单敲除株和farR与argR双敲除株;采用荧光定量PCR方法分析了farR、argR敲除及其组合敲除后精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化。【结果】在ArgR蛋白缺失的情况下,FarR可能发挥正调控功能;在ArgR存在时,敲除farR,目标基因的转录水平改变存在不一致性,表现出上调、下调或无影响。【结论】钝齿棒杆菌中FarR和ArgR在精氨酸生物合成途径的调控中存在关联性。     

蛋白质赖氨酸乙酰化修饰对中间代谢的调控研究

生命活动的中间代谢酶存在大量的赖氨酸乙酰化修饰作用,这些在特定位点进行的可逆的赖氨酸乙酰化修饰作用能精确地调控胞内各种代谢路径。因此,对中间代谢酶赖氨酸乙酰化的研究成为了当今热点。对中间代谢酶的乙酰化修饰的研究进展进行综述,并归纳了几种典型的中间代谢酶的可逆乙酰化作用及其乙酰化位点的分布和在中间代谢路径中重要的调控作用,以期为深入研究蛋白质乙酰化修饰提供参考。     

吴城鄱阳湖自然保护区鱼体重金属的富集及安全性评价

为研究吴城鄱阳湖自然保护区鱼类重金属的污染情况, 以鄱阳湖吴城6种常见淡水鱼(鲤、鳙、鲢、草鱼、青鱼、鳊)为研究对象, 分别研究鱼心脏、肝脏、鳃丝和肌肉等部位中铜、锌、铅、镉4种重金属的富集情况, 并采用目标危险系数(THQ)评价其健康风险。结果显示, 重金属元素在鱼体不同器官中的富集程度不同, Cd在肝脏中的含量最高, Cu在肝脏和心脏中的含量最高, Pb在肝脏中的富集含量最低, Zn在各器官的总体含量要高于其他3种元素。4种重金属在鱼肌肉中的含量均符合国内外标准。目标危险系数(THQ)分析结果表明, Pb导致的健康风险最高, Cd最低, 单一重金属THQ值和复合重金属TTHQ值均小于1, 说明吴城鄱阳湖自然保护区鱼类重金属的污染程度较低, 不会对消费者健康产生潜在危害。     

代谢工程改造微生物高产氨基酸的策略

氨基酸作为一类营养物质在维持机体正常的生理生化反应方面具有重要的功能,常用作食品、药品和化妆品等的添加剂。氨基酸的生产主要依靠微生物发酵,产氨基酸菌的选育却是制约大规模工业生产氨基酸的重要因素。随着微生物分子育种技术的发展和运用,利用代谢工程改造细胞本身固有的代谢网络,指导氨基酸高产菌的选育已成为当前研究的热点。以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为例,就该菌株代谢网络的特征以及高产氨基酸的代谢工程策略和应用进行综述。     

赭曲霉毒素A降解菌株的筛选及脱毒酰胺水解酶的基因克隆和表达

【背景】赭曲霉毒素A (ochratoxin A, OTA)是一种可以致癌的真菌毒素,其污染严重影响食品安全,危害人类健康。生物降解法去除OTA污染是近些年的研究热点,发掘高效的OTA降解脱毒酶资源具有重要的意义。【目的】筛选高效的OTA降解菌株并从中克隆降解基因,为生物脱毒方法的开发提供基因和酶资源。【方法】利用OTA为唯一碳源的筛选培养基从土壤中筛选纯化OTA降解菌株,通过16S rRNA基因序列分析确定其分类地位,利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)分析其降解产物。通过同源序列比对的方法克隆降解基因并与载体pET-29a(+)相连,然后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。利用Ni²⁺亲和层析对表达产物进行纯化,研究其对OTA的降解活性和酶学特征。【结果】筛选到一株高效的OTA降解菌株,在12 h内能够完全降解1 μg/mL的OTA;初步鉴定该菌株属于Niastella,编号为JX-6;菌株JX-6通过酰胺键断裂途径降解OTA生成无毒的OTα;从菌株JX-6中鉴定了一个OTA酰胺水解酶,命名为NcOTase;NcOTase与已报道的OTA酰胺水解酶序列相似性较低,仅为31%–53%;纯化的NcOTase具有OTA水解活性,比酶活为60.3 U/mg,活性显著高于大部分已报道的OTA降解酶。【结论】NcOTase是一个高效的OTA降解脱毒酶,在去除食品和饲料中OTA污染方面具有很好的应用前景。     

比较pta及ack敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

旁支代谢途径的截断有利于目的氨基酸合成途径的集流。基于基因组尺度代谢网络模型的预测,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过无痕敲除技术分别敲除了编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因及编码乙酸激酶的ack基因,阻断了乙酸的合成。摇瓶发酵结果表明,pta缺失菌株精氨酸产量较出发菌株提高了25.60%,达15.46g/L。葡萄糖转化率提高了29.41%;ack缺失菌株精氨酸产量达13.82g/L,较出发菌株提高了12.81%,葡萄糖转化率提高了26.02%。同时,pta及ack敲除菌株的细胞生长较出发菌株均分别提高了9.19%及7.71%。因此,pta、ack的敲除不仅有利于精氨酸的合成,而且对菌体生长具有促进作用;但pta的敲除更有利于精氨酸的积累。