马立克氏病病毒超强毒感染鸡羽髓蛋白质组分析

【目的】羽毛是细胞游离马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)释放的部位,为了解感染MDV后鸡羽中宿主基因表达的变化及对病毒感染的应答,进行了MDV感染鸡的羽髓蛋白质组学分析。【方法】1日龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡人工感染MDV超强毒RB1B株(1000PFU),感染后21d采集鸡羽毛,提取羽髓蛋白,以17cm,pH5-8的IPG胶条进行二维电泳,以未感染病毒的SPF鸡羽髓蛋白为对照,使用PDQuest软件对二维电泳图谱进行差异蛋白分析,并选取部分差异斑点进行质谱鉴定。【结果】PDQuest软件分析发现攻毒组和对照组表达差异大于两倍的蛋白点有41个,其中攻毒组表达上调的蛋白点25个,下调的蛋白点7个,新出现的蛋白点有9个。质谱分析共成功鉴定了21个斑点,对应于20个蛋白。如载脂蛋白AI(apolipoprotein AI)、14-3-3 sigma(两个斑点均为该蛋白)、癌蛋白18(stathmin)等。【结论】功能预测表明这些蛋白涉及到宿主的抗病毒应答、物质代谢、细胞骨架成分、细胞增殖相关等方面。     

晶胞接种法在肌动蛋白和木聚糖酶结晶中的应用

晶胞接种法（seeding technique）包括微晶胞接种法（micro-seeding technique）和大晶胞接种法（macro-seeding technique）.微晶胞接种法主要用于改善晶体的衍射质量.大晶胞接种法主要用于得到大体积晶体以提高衍射分辨率,尤其是晶体的中子衍射分辨率. 本文采用连续多次微晶胞接种法极大地改进了肌动蛋白（actin）晶体的衍射质量,获得的单晶X-光衍射分辨率达到1.9 Å. 本文丰富了大晶胞接种法的内容,以此技术获得了体积达到2立方毫米的木聚糖酶(xylanase)巨大单晶, 其中子衍射分辨率达到了2.0 Å ,从而为它的第一个中子衍射晶体结构的解析奠定了坚实的基础.     

鼠脑驱动蛋白的表达、纯化和结晶

驱动蛋白是一类利用水解ATP为ADP和磷酸的过程中释放的能量沿微管系统运动的蛋白。为了研究ATP中储存的化学能是如何转化为驱动蛋白的机械动能,鼠脑驱动蛋白的相关N-端区域在BL21-Codon Plus(DE3)-RP感受态大肠杆菌细胞中大量地表达。通过SP-强阳离子交换色谱和分子筛色谱的两步骤纯化,蛋白最终产量高达10 mg/L细胞培养液,蛋白纯度可以达到95%以上。纯化的蛋白具有水解ATP酶的活力,并与驱动蛋白抗体有特异性的反应。驱动蛋白可以在如下条件结晶:1.7 mol/L(NH4)2SO4,500 mmol/L NaCl,20%glycerol。晶体衍射的分辨率可以达到2.0。     

鼠脑驱动蛋白ATP水解机制的晶体学分析

鼠脑驱动蛋白是一类利用ATP水解释放的能量在微管系统上高连续性运动的常规驱动蛋白。了解ATP水解的化学能如何转化为机械动能是驱动蛋白研究中的重大课题。为此,鼠脑驱动蛋白单体(rK354)的晶体通过浸泡的方式引入ATP的结构类似物AMPPNP。rK354-AMPPNP复合物和rK354-ADP复合物结构的比较,揭示了开关区域Ⅱ的Glu237起连接ATP的γ-磷酸和驱动蛋白微管结合区的枢纽作用。