水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析

利用反向遗传学的方法对水稻OsCIPK10基因的功能进行了分析。结果表明,过量表达OsCIPK10基因的转基因水稻与野生型水稻在株型、抗高盐和耐低钾能力方面没有明显差异,但是小RNA干扰表达OsCIPK10基因的转基因水稻表现出显著的抗盐性。在缺钾胁迫条件下OsCIPK10基因的表达升高,推测该基因在应答高盐和低钾的非生物胁迫过程中起作用。OsCIPK10基因启动子与报告基因GUS融合表达的转基因水稻的染色结果显示:OsCIPK10基因呈组成型表达,但是在维管组织表达水平更高。     

水稻黄矮弹状病毒的leader区和trailer区的序列分析及其体内转录物的鉴定

克隆及测定了水稻黄矮病毒基因组RNA的 3′端leader区和 5′端trailer区的序列 .结果表明 ,RYSV的 3′leader长 2 0 3个核苷酸 ,5′trailer长 191个核苷酸 .两者末端的 9个核苷酸完全互补 ,可形成弹状病毒基因组RNA的典型的锅柄结构 .与其他弹状病毒的leader和trailer相比较 ,RYSV的leader和trailer较长 ,除leader的 3′末端和trailer的 5′末端序列具有一定的保守性外 ,其余的核苷酸序列无明显的同源性 .用 3′RACE方法在感染RYSV的水稻中检测出leader的转录物 ,并证明该leaderRNA具有polyA尾巴 .这是继苦苣菜黄脉病毒的leaderRNA后第 2例弹状病毒leaderRNA带polyA尾巴的报道 .用类似的方法没有检测到带polyA尾巴的trailer的正链转录物 .     

水稻黄矮病毒基因2的核苷酸序列

从水稻黄矮病毒基因组的ｃＤＮＡ文库中,获得了包含邻接核衣壳蛋白基因的基因２的克隆,并测定了其核苷酸序列。ＲＹＳＶ基因２的５‘端起始序列推测为５’ＡＡＣＡＣ－３‘,该起始序列与ＲＹＳＶ其他基因及其他弹状病毒基因的５’端起始序列高度同源。     

黄瓜花叶病毒互补型载体可与CP转基因发生重组

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)作为表达载体的可行性,克隆了山东株(SD)CMV RNA3的全长cDNA,并测定了全序列.采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点.以绿色荧光蛋白(GFP)基因置换SD-CMV RNA3 cDNA的CP基因.将Fny株CMV RNA1,RNA2和嵌合SD-CMV RNA3的cDNA分别克隆在35 S启动子和终止子之间构建成表达载体.在烟草原生质体中验证了该表达载体可以表达GFP.然后将其接种到表达SD CP的转基因烟草上,试图构建成一个互补型载体.接种10d后,18棵植株中,有5棵的接种叶和其中1棵的系统叶上可检测到表达的GFP.然而1个月后,所有接种植株中都检测不到GFP.通过RT-PCR及序列分析,证实在互补系统中CMV载体与CP转基因发生了重组.上述结果对这种CMV互补型载体的可行性提出了质疑,同时也揭示了转CMV CP基因抗病毒植物的生物安全性中存在的新的问题.     

放射土壤杆菌HLB-2菌株抑制葡萄根癌土壤杆菌生长和冠瘿形成的研究

在山东莱西啤酒花冠瘿瘸发病严重地区,从啤酒花冠瘿中分离到一株无致病性的土壤杆菌,经鉴定为放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)HLB-2,属于生物I型。HLB-2菌株在培养基上产生一种类似土壤杆菌素84的物质,能抑制葡萄根癌土壤杆菌生物III型菌株的生长。在温室接种试验中,可以完全抑制16株致病力不同的葡萄根癌土壤杆菌中的14株菌(含octopine或nopaline质粒)在向日葵幼苗和葡萄幼枝上诱发冠瘿病。 在培养基上测定敏感性的结果和温室冠瘿病抑制试验的结果一致,表明HLB-2菌株的防病机制可能是由于它所产生的土壤杆菌素。在对比试验中,K84菌株和D286菌株对葡萄根癌土壤杆菌均无抑制作用。以上结果表明,HLB-2菌株在葡萄冠瘿病的生物防冶中有一定的实用价值。     

A组轮状病毒多个结构蛋白抗原表位的串联表达及其免疫原性的检测

从北京腹泻婴儿粪便提取的轮状病毒(rotavirus,RV)(T114株)的RNA中,克隆到轮状病毒结构蛋白基因vp4,vp6和vp7的全长cDNA,对它们编码的蛋白质序列和可能的抗原表位肽进行了预测,选择了RV主要抗原蛋白VP7、VP6和VP4的4个抗原表位肽,通过人工合成DNA的方式将这些抗原表位肽基因串联融合成一个阅读框RME(rotavirus multipleepitopes,RME)并构建原核表达载体.大肠杆菌表达的RME在ELISA反应中可被RV多克隆抗体识别,纯化的RME蛋白注射免疫小鼠可诱导特异性免疫应答,产生高滴度的同源氨基酸序列特异抗体和人RV抗体,其中针对RME的IgG抗体滴度达到l∶40 000,针对单个抗原表位EV7、EV6和EV4的IgG抗体滴度达l∶10 000～l∶20 000,针对RV Wa株的IgG抗体滴度较低为l∶2 500,但能特异地中和该病毒对MAC145细胞的侵染.上述结果为新型RV基因工程疫苗的研发提供了论据和基础.     

胃癌穿孔64例外科治疗探讨

目的:探讨姑息切除术胃癌穿孔治疗效果。方法:选取2006年1月到2011年1月于我院进行治疗的64例外科治疗患者为研究对象,将其随机分为A组(姑息切除术组)32例和B组(穿孔修补术组)32例,后将两组患者术后生存率和并发症进行统计及比较。结果:A组患者术后生存率和并发症明显好于B组,P<0.05,有显著性差异。结论:胃癌穿孔在姑息切除术下有明显效果,应在临床中广泛应用。     

利用不相容质粒共转化大肠杆菌对Cre重组酶体内重组活性的可视检测

源自噬菌体P1的Cre重组酶可以识别 34bp的靶DNA序列loxP ,进行位点特异性的重组反应。为了简便地检测Cre酶在大肠杆菌中的重组活性 ,分别将cre基因和上下游带有loxP的绿色荧光蛋白基因 (gfp)克隆到具有不同抗性的两种不相容质粒中 ,然后将构建的原核表达载体pET30a Cre和pET2 3b loxGFP电击共转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,利用卡那霉素和氨苄青霉素双抗生素抗性进行筛选。通过直接观察转化子的绿色荧光 ,便可以显示Cre酶的体内重组活性 ,并进一步通过SDS PAGE分析、质粒酶切鉴定进行了验证。结果表明 :以gfp为报告基因、通过两种不相容质粒共转化大肠杆菌可以为研究和改进Cre loxP重组系统提供一种简便直观的检测方法     

茶树叶际选择性富集的内生细菌的鉴定

【目的】茶树(Camelliasinensis)为多年生常绿木本植物,其叶片用于生产茶叶。本论文通过测定茶树叶际内生细菌的菌群组成,比较叶际内生菌与土壤菌群的异同,以鉴定选择性富集于茶树叶际的内生细菌。【方法】本研究采集湖北宜昌邓村茶树,对茶叶表面进行除菌处理,提取茶叶及其内生细菌的总基因组DNA,通过细菌16S核糖体RNA基因(16S rDNA)保守区引物799F和1193R扩增16Sr DNA的V5–V7可变区序列,并通过Illumina二代测序平台对扩增子进行建库测序。【结果】茶叶内生菌群由变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和极少量的梭杆菌门(Fusobacteria)5个门,共百余属组成,其中,甲基杆菌属(Methylobacterium)、代尔夫特菌属(Delftia)、微杆菌属(Microbacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、Aureimonas和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等以较高丰度富集于叶片组织内部。约40%的茶叶叶际内生细菌也在相应的土壤中存在,表明其可能的土壤来源;非土壤来源的茶叶内生细菌达60%,如Aureimonas和Delftia等。【结论】本研究解析了茶树叶际内生细菌的群落组成与结构,分析了内生细菌的可能来源,为以叶际内生菌为靶标,改善茶叶品质、降解农药残留、防御茶叶病虫害的研究提供基础。