Spindle-view系统在猪卵母细胞去核中的应用

应用Spindle-view对体外成熟培养36、42、44和48h的猪体外成熟卵母细胞减数分裂纺锤体进行去核操作,并与传统去核方法(McGrath-Solter去核法,挤压去核法)相比较,结果表明:①在42~48h之间利用Spindle-view得到的猪卵纺锤体影像与极体的相对位置没有明显的变化;②Spindle-view适合用于猪体外成熟卵母细胞减数分裂纺锤体的观察及去核;去核效率与其他两种方法相比差异极显著(95.5%,42.1%,74.2%,P<0.01);③纺锤体成像是否清晰可用于猪卵母细胞的质量监控。     

利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因打靶载体

利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。本实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上,利用Red重组系统,通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47Kb无启动子的HPRT基因组片段（不含有第1个外显子）克隆到pBACLinkSp质粒上,产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于本实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。     

分化细胞经特定因子诱导重编程为多能干细胞

胚胎干细胞在再生医学领域有着十分诱人的应用前景。但是现有胚胎干细胞建系技术不能避开对卵细胞的操作, 成为ES细胞临床应用的障碍。通过反转录病毒载体系统, 在小鼠和人类高度分化细胞中表达干细胞因子Oct4, Sox2, Klf4和/或c-Myc等基因, 再经过干细胞标志因子Nanog或Oct4筛选, 可以获得与ES细胞特性十分近似的诱导多能干细胞系。这种不依赖于卵细胞的多能干细胞建系方法无疑是干细胞实验技术的重大进展, 也是对现有重编程理论假设的突破。综述了诱导多能干细胞系建系实验结果, 并对诱导重编程的机制和诱导多能干细胞系的临床应用前景进行了讨论。     

利用CRISPR-Cas9敲除Tyr基因制作白化C57BL/6N小鼠

目的 为了获得白化的C57BL/6N小鼠,扩大其在皮肤移植和胚胎干细胞方面研究中的应用。方法 通过体外设计合成Cas9 mRNA和系列sgRNA(single guide RNAs),注射到小鼠的受精卵内,破坏合成C57BL/6N小鼠黑色素生成必须的酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因序列的第1和第2外显子,产生基因突变,获得F0代白化的C57BL/6N小鼠,然后经过重复回交和自交,形成白化C57BL/6N小鼠近交系。结果 经过注射两对sgRNA,成功的获得了F0代的白化小鼠,在Tyr基因的第1和第2外显子中均发生了缺失突变,小鼠可以将突变基因传递给后代,并在其后代中产生了纯合的白色C57BL/6N小鼠,最后对白化小鼠突变类型进行了分析。结论 通过CRISPR-Cas9技术破坏了小鼠Tyr基因,成功地建立了白化C57BL/6N小鼠近交系,为将来的嵌合体制作、组织移植提供了新的研究工具。     

设施番茄果实生长与环境因子的关系

在设施环境下,研究环境因子与番茄果实生长的关系,以期为设施番茄精准管理提供参考。以1h为步长,记录设施内温度、光照强度及空气湿度,每7d进行1次果径测定,将采集的环境数据细分为7个变量,分析7个变量与果实日增量随时间的变化,采用DPS软件进行逐步回归,建立显著环境因子与果实日增量的回归模型。春茬两个棚环境因子随时间动态变化规律较一致,秋茬日光温室与其有所不同。番茄品种'粉冠’和'金棚’果实日增量呈现先升高后降低的趋势,品种'珍琪’果实日增量变化波动较大。3个设施内影响果实日增量的显著环境因子有所不同,7个环境变量之间相互影响、相互制约。剔除不显著的环境变量后,建立了3个番茄品种果实日增量与显著环境变量的回归模型,确定了7个环境因子对果实生长的影响及果实生长适宜的环境变量范围。     

应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase,HGPRT)的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关.制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究.构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%.RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRTmRNA和蛋白质表达量明显降低.最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著.说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件.     

哺乳动物体细胞核移植研究进展及应用前景

哺乳动物体细胞核移植克隆技术成功于１９９７ 年,曾引起世界范围内的广泛关注,本文综述了体细胞克隆技术在近两年内的最新研究进展及其在生产、医疗和科学研究方面的应用前景。     

利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除

利用EL350基因工程菌进行同源重组, 成功进行基因敲除已有报道, 但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛b 酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体, 设计不同的同源臂, 成功地敲除了b 酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列, 插入新的基因, 研究其表达功能, 或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

兔Oct4启动子驱动RFP基因表达载体的构建及验证

转录因子OCT4在维持和调控胚胎干细胞的多能性中发挥着重要的作用。Oct4基因启动子驱动标志蛋白的表达对研究胚胎干细胞多能性和建立iPs细胞有重要意义。由于GFP在慢病毒转染过程中常用作转染标记,计划构建兔Oct4基因启动子（rOct4）驱动红色荧光蛋白表达的载体,这将有利于兔ES细胞和iPS细胞制备的研究。通过PCR方法扩增rOct4,构建了rOct4驱动RFP基因的表达载体rOct4-RFP。经转染小鼠ES细胞验证正确后,将rOct4-RFP质粒转染兔成纤维细胞系获得rOct4-RFP成纤维细胞系。经过酶切和测序验证,证明rOct4-RFP构建成功,而且能够在小鼠Es细胞系E14中表达细胞红色荧光蛋白,并受细胞分化状态的调控。通过脂质体介导的基因转移、抗性筛选和PCR鉴定建立了rOct4-RFP转基因成纤维细胞系。     

成体兔转基因成纤维细胞的克隆分离及其核移植研究

哺乳动物体细胞核移植及其与转基因技术的结合为转基因动物的研究提供了新的思路和方法．然而,单个转基因细胞克隆的分离培养一直比较困难,很大程度上限制了转基因动物的研制．将pRNAT-U6.1/Neo质粒转染成体兔成纤维细胞,通过24孔细胞培养板分离培养法获得来源于单个转基因成纤维细胞克隆．由于单个成纤维细胞克隆在新鲜DMEM培养液中生长比较困难或缓慢,采用由DMEM/F12制备的条件性培养液进行筛选．以转基因成纤维细胞为供体细胞进行核移植,囊胚率为23.5%,与来源于成体兔正常成纤维细胞相比较差异不显著．并且利用PCR或多重PCR方法鉴定筛选的转基因细胞克隆及其核移植胚胎中整合的Neo^R基因和常染色体β-actin DNA．为转基因哺乳动物细胞的分离培养和核移植胚胎的鉴定提供可靠的方法,缩短了转基因动物的研制周期,降低生产成本,同时为进一步通过核移植技术获得转基因克隆兔提供了条件