球孢白僵菌高渗适应性相关基因Bbmpd的克隆与表达分析

【目的】克隆与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的高渗适应性相关基因,并对其功能进行分析,以揭示球孢白僵菌对高渗等逆境适应的分子机理。【方法】利用YADE法克隆T-DNA的侧翼序列并进行基因组步行,获得突变基因的全长及上游序列;利用RT-PCR技术分析突变基因的表达特性以及与Bbhog1的关系;采用同源重组技术敲除Bbmpd基因。【结果】克隆得到插入突变基因及其上、下游序列全长3037bp。该基因与编码球孢白僵菌的1-磷酸甘露醇脱氢酶基因相似性为98%。Bbmpd的表达受高渗环境(0.8mol/L NaCl)的诱导,受Bbhog1信号途径的激活调节,Bbhog1缺失导致Bbmpd表达下调。Bbmpd缺失突变体在高渗胁迫下的生长受到明显抑制。Bbmpd缺失不影响球孢白僵菌在查氏培养基上的生长和产孢。【结论】由T-DNA突变体克隆了编码球孢白僵菌1-磷酸甘露醇脱氢酶基因Bbmpd,该基因的表达受高渗环境的诱导和Bbhog1的调控,与球孢白僵菌高渗适应性相关。     

球孢白僵菌T-DNA突变体库的构建及高温和高渗敏感型突变体的筛选

摘要：【目的】筛选对高温和高渗等逆境胁迫敏感的球孢白僵菌T-DNA随机插入突变体,并克隆相关基因,为研究杀虫真菌适应逆境的分子机理奠定基础。【方法】利用逆境胁迫的方法从球孢白僵菌的T-DNA随机插入突变库中筛选对高温和高渗敏感的突变体,进而利用YADE (Y-shaped adaptor dependent extension)技术克隆相关基因。【结果】筛选得到5个对高温和高渗敏感的突变体。其中2个（212和2550）对高温敏感,在32oC下生长完全受抑;其它3个突变体对高渗胁迫敏感。突变体212的分生孢     

利用GFP表达系统检测球孢白僵菌侵染昆虫过程

The green fluorescent protein (GFP) has been expressed in a variety of organisms and has been used extensively as a marker in the study of host-pathogen interaction. We have expressed GFP in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana through transformation with a vector that confers resistance to phosphinothricin. Conidia expressed GFP and were readily detected by fluorescence microscopy. Fluorescent hyphae and conidia were easily distinguished in the tissue of the cabbage worm. GFP-tagged strains of B. bassiana could be used to study the developmental fate of the fungus within its insect hosts. Thus, this method is useful for screening and monitoring the engineered strains even after infection.     

一个小指畸形家系

正常人的手在五指并拢时 ,5个手指的指骨相互间几乎成平行状 ,而且每 1个手指的 3节指骨 (大拇指 2节 )通过关节相连 ,指骨的长轴也在一直线上。但在江苏省张家港 ,发现了 1个小指畸形家系 (图 1) ,现将结果报道如下 :先证者 : 6黄某 ,男 ,2 1岁 ,右手掌骨均属正常 ,小指第 1节指骨与第 2节指骨通过关节相连 ,其长轴也在一直线上 ,但先天第 3节指骨偏离第 1、2节指骨的长轴线 ,从关节处开始弯向内侧 ,靠向无名指。第 3节小指骨偏离第 1、2节指骨的长轴延长线约 4 0度 (图 2 )。同时 ,患者五指并拢时 ,指骨可上翘与掌骨的长轴方向成 30度夹角…     

球孢白僵菌FUS3/KSS1类MAPK同源基因(BbMPK1)的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌FUS3/KSS1类MAPK的保守序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK基因的部分片段,进而利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK基因的全长序列,命名为BbMPK1。用3′RACE扩增出BbMPK1的全长cDNA序列,该序列含有一个1071bp的ORF,编码356个氨基酸的多肽,推测分子量为41.2kDa,等电点为6.61。BbMPK1含有11个MAPK共有的蛋白激酶区域和1个MAPK激酶作用的磷酸化位点区域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的TMKA、PMK1、CMK1、FMK1和BMP1等MAPK高度同源。系统聚类结果表明,BbMPK1属于酵母FUS3/KSS1类MAPK。Southern杂交表明,BbMPK1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR分析表明BbMPK1在分生孢子休眠阶段、萌发阶段和菌丝生长时期均表达。研究结果为阐明酵母FUS3/KSS1类MAPK同源基因在球孢白僵菌中的作用奠定了基础。     

球孢白僵菌FUS3／KSS1类MAPK同源基（BbMPK1）的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌FUS3／KSS1类MAPK的保守序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK基因的部分片段,进而利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK基因的全长序列,命名为BbMPK1。用3’RACE扩增出BbMPK1的全长cDNA序列,该序列含有一个1071bp的ORF,编码356个氨基酸的多肽,推测分子量为41．2kDa,等电点为6．61。BbMPK1含有11个MAPK共有的蛋白激酶区域和1个MAPK激酶作用的磷酸化位点区域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的TMKA、PMK1、CMK1、FMK1和BMP1等MAPK高度同源。系统聚类结果表明,BbMPK1属于酵母FUS3／KSS1类MAPK。Southern杂交表明,BbMPK1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR分析表明BbMPK1在分生孢子休眠阶段、萌发阶段和菌丝生长时期均表达。研究结果为阐明酵母FUS3／KSS1类MAPK同源基因在球孢白僵菌中的作用奠定了基础。     

黄土高原植被恢复引发区域气温下降

黄土高原退耕还林(草)等生态恢复工程促进了地表植被覆盖增加,进而通过影响地表-大气之间热量交换影响区域气候过程。基于黄土高原1998—2000年和2008—2010年SPOT卫星反演的植被覆盖资料、54个地面气象站气温资料及EIN-Interim地表热通量数据,采用空间分析交叉验证及地表热量平衡分析的方法,从站点尺度探讨了退耕还林(草)工程初期和10年后黄土高原植被变化与气温和地表热通量变化之间的关系。研究表明,退耕还林(草)工程开展10年后,黄土高原气温最小值、最大值与平均值均有下降,植被覆盖增加与气温变量降低在空间上呈正相关。同时,植被覆盖增加与潜热通量增加、感热通量与大气下行长波辐射下降在空间上也呈正相关关系。这些结果表明,植被恢复可通过增加地表蒸散发作用对区域气候产生降温效应,会减缓气温升高对黄土高原生态系统的影响。     

更昔洛韦在D+/R+肾移植术后预防CMV 感染的疗效观察

目的:观察D+/R+肾移植术后人群应用更昔洛韦预防巨细胞病毒感染的疗效与安全性。方法:我院2003年5月至2011年11月期间D+/R+同种异体肾移植患者93例,肾移植术后预防性应用更昔洛韦,对移植后1年内巨细胞病毒的感染率、感染发生的时间及有症状的CMV发病率进行以及用药后不良事件进行分析。结果:在D+/R+肾移植人群中预防性使用更昔洛韦后的感染率为28%,有症状的CMV发病率4.3%,病毒血症的平均感染时间为231.3 d,严重不良事件发生率为45.1%。结论:在D+/R+肾移植术后患者中预防性更昔洛韦能够预防CMV感染并且延长CMV初次感染时间,使D+/R+肾移植患者获益。     

利用GFP表达系统检测球孢白僵菌侵染昆虫过程

绿色荧光蛋白(GFP)作为一种重要的报告基因,在病原菌和寄主之间的互作研究中具有良好的应用前景。利用草丁膦抗性基因bar为筛选标记,构建了组成性表达绿色荧光蛋白基因egfp的载体pBG,并转入球孢白僵菌获得成功表达。将转化子接种菜青虫进行生物测定表明,组成性表达egfp不影响球孢白僵菌的毒力。进一步利用冰冻切片和荧光显微观察技术监测球孢白僵菌侵染寄主行为,结果显示,通过荧光观察可清楚的检测到病原菌在昆虫体表的附着、菌丝穿透体壁以及菌丝从寄主体内长出等侵染过程。由此表明,GFP可有效用于球孢白僵菌的遗传标记,进行病原菌的鉴别、侵染致病机理及相关功能基因的表达模式研究。     

蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的克隆及表达分析

采用筛选cDNA文库的方法,首次克隆了蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的全长cDNA序列和DNA序列,序列分析表明,蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy不含内含子,开放阅读框（ORF）为1,074bp,编码357个氨基酸,推测蛋白的分子量为39.78kDa,等电点（pI）为5.53;利用在线软件分析表明,该蛋白既不是分泌型蛋白也不是膜蛋白;同源性比对结果表明,该蛋白与其他真菌中的氰化物水合酶蛋白的同源性较高,具有高度保守的催化三联体特征。用qRT-PCR方法分析了该基因在蝗绿僵菌侵染昆虫过程中的表达情况,结果表明,MaChy在蝗绿僵菌侵染穿透昆虫体壁阶段的表达量最高,约为体内阶段表达量的2.5倍,推测该基因可能在蝗绿僵菌穿透昆虫体壁的过程中起重要作用。