利用系统作图(Systems mapping)研究大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的互作遗传机制

【背景】物种间相互作用是物种进化的重要推动力,然而如何将基因型和表型关联以及确定在物种相互作用过程中起重要作用的基因均面临挑战。【目的】通过系统作图(Systems mapping)得到两种微生物在相互作用过程中起重要作用的SNPs (Single nucleotide polymorphism),以及随着时间的变化,这些SNPs是如何相互联系进而影响大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的相互作用。【方法】分别对45株大肠埃希菌、45株金黄色葡萄球菌进行单独培养和混合共培养,通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)进行绝对定量,得到一定时间内各个菌株的生长量,比较相同菌株在不同培养条件下生长情况,以各个菌株重测序结果为基础,结合系统作图得到在相互作用过程中起重要作用的显著SNPs及其相互联系。【结果】通过系统作图分析,获得具有54对显著SNPs组合的三维曼哈顿图,这些组合中41个显著SNPs来自大肠埃希菌,12个显著SNPs来自金黄色葡萄球菌。在上述SNPs中已有6个SNPs所在的候选基因都可以直接或者间接影响微生物的生长量变化,从而影响两种微生物相互作用方式。它们分别是nhaR(E19056)参与生物膜的形成,rhlE(E832164)与核糖体的组装有关,csiD (E2789300)的表达可以使细胞面对恶劣环境,alk B (E2309274)可以参与DNA的损伤修复,sucA(E759230)和yjjW(E4614704)都参与细胞的代谢过程。【结论】系统作图可以检测到物种在相互作用过程中显著SNPs;物种相互作用过程中不同SNPs遗传效应随着时间变化;细菌的相互作用过程是直接遗传效应、间接遗传效应和上位性效应共同产生的结果。     

长江三峡上游水域细菌群落结构与功能预测

【目的】揭示三峡附近支流和长江干流细菌群落组成，共现网络特征和对网络有重要作用的中心节点微生物，进一步研究三峡上游水域细菌群落的代谢功能。【方法】本研究于长江北岸四条一级支流和附近干流(香溪河、大宁河、朱衣河、梅溪河、长江干流)采集水样，基于16S rRNA基因Pacbio测序技术和生物信息学方法分析细菌群落结构，Tax4Fun功能预测分析细菌群落的代谢功能。【结果】(1)长江三峡上游水域主要优势菌门为变形菌门(Proteobacteria,66.4%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,13.2%)和蓝细菌门(Cyanobacteria,6.2%)。变形菌门中，γ-变形菌最为丰富，其次是α-变形菌。多样性指数和丰富度指数表明研究区域微生物种类较为丰富。(2)共现网络分析结果表明，长江三峡上游附近水域网络具有“小世界”特征，鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、绿弯菌门(Chloroflexi)、出芽菌科(Gemmataceae)、弯曲杆菌(Flectobacillus)和蟑螂杆状体科(Cryomorphaceae)是对共现网络结构有重要作用的中心节点微生物，在群落结...     

嗜热绿色糖单孢菌木聚糖酶XyN10A基因在毕赤酵母中的分泌表达及其酶学性质研究

木聚糖酶(Xylanase)可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素,由于其在饲料、食品、造纸等领域的广泛应用,越来越受到人们的关注。利用分子生物学技术首次成功构建了一株高效表达嗜热绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)木聚糖酶SviXyN10A的重组工程菌,建立了SviXyN10A的毕赤酵母表达体系,实现了SviXyN10A在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达,并对表达产物进行了诱导表达及纯化,以及酶学性质的研究。结果表明,重组木聚糖酶SviXyn10A用甲醇诱导2 d后酶活即达到7.53IU/mL,最适反应温度为70℃,pH7.0。pH作用范围较广(pH5.0-9.0),具有较强的热稳定性和耐碱性,几乎没有纤维素酶活性,故可以应用在很多工业领域,尤其是在纸浆造纸行业具有很大的潜在应用价值。     

体外诱导耐万古霉素金黄色葡萄球菌及分子机制

【目的】通过前期体外诱导获得耐万古霉素金黄色葡萄球菌,从基因突变方面对万古霉素耐药性菌株进行研究。【方法】通过低浓度万古霉素逐步诱导13株敏感性金黄色葡萄球菌,用琼脂稀释法和E-test法检测所有菌株对万古霉素的耐药性(最低抑菌浓度,MIC),PCR扩增与万古霉素耐药性密切相关的4个重要基因:rpo B、vra S、gra R和gra S,并测序分析,比较诱导前后不同菌株的基因序列。【结果】通过60 d的体外诱导实验,13株对万古霉素敏感性金黄色葡萄球菌中有6株被诱导为中介耐药金黄色葡萄球菌(Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus,VISA),7株菌被诱导之后对万古霉素仍处于敏感状态,MIC4 mg/L。检测诱导前后所有菌株的rpo B、vra S、gra R和gra S基因发现:有3株VISA的rpo B基因同时有L466S和H481N的突变,gra S基因同时有R232K的突变。【结论】对万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌经过较长时间的体外诱导可发展为VISA。在已检测的重要基因中,rpo B和gra S的突变对耐药性的发展很可能起关键作用,而vra S和gra R对这一过程没有显著影响。     

微囊化新生大鼠卵巢组织体外及异体移植

为探讨海藻酸钠-聚左赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊化新生大鼠卵巢组织用于治疗实验性卵巢功能丧失大鼠的可行性,应用高压静电法,用海藻酸钠-聚左赖氨酸-海藻酸钠(APA)生物膜包裹新生大鼠卵巢组织,体外培养微囊,用免疫化学分析法检测雌二醇(E2)、孕酮(P)分泌情况,透射电镜观察卵巢组织形态,并将微囊移植到去势大鼠(切除双侧卵巢的雌性大鼠)腹腔中,检测大鼠血清中雌、孕激素变化情况,同时用阴道涂片观察大鼠动情周期恢复情况,并在不同时间回收观察微囊。结果显示在相同条件下制得的微囊粒径均匀、表面光滑;体外培养条件下持续分泌E2、P;卵巢组织中颗粒细胞发育成为粒性黄体细胞;大鼠腹腔移植微囊后无异常,E2、P水平上升,动情周期未恢复;回收的微囊大部分形态完整。提示用高压静电法制备的APA微囊化新生大鼠卵巢组织能持续稳定释放E2、P,明显改善大鼠卵巢功能,在大鼠体内有良好的生物相容性。     

不同培养条件下金黄色葡萄球菌表型可塑性研究

表型可塑性在生物界普遍存在,但在微生物领域的研究相对较少,利用分子标记技术研究微生物表型可塑性方法也鲜有报道。用1株大肠埃希菌与45株金黄色葡萄球菌混合培养营造竞争环境,测定其生长量并与相同起始浓度单独培养的金黄色葡萄球菌生长量做GWAS对比,得到显著SNP位点。分析SNP位点中与金黄色葡萄球菌生长变化相关的基因表达量变化情况,研究其与金黄色葡萄球菌表型可塑性的关联性。以45株金黄色葡萄球菌在两种模式下生长量及全基因组测序结果为基础,利用双变量全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)法筛选与金黄色葡萄球菌生长量显著相关的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,定位这些SNP位点对应的金黄色葡萄球菌基因,从这些基因的功能中筛选与金黄色葡萄球菌生长变化相关的部分并汇总分析。之后选取其中关联性较强的scdA基因序列为模板设计引物,用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR,qPCR)的相对定量法,选用16S rDNA为内参基因,测定两种培养环境下基因的mRNA相对表达量,统计分析差异性。结果显示,与大肠埃希菌混合培养的金黄色葡萄球菌受其影响生长量显著降低。GWAS在12个取样点共检测出415个显著SNP位点,筛选后对scdA基因两种培养条件下的相对表达量进行测量并统计分析,结果显示无论251050位点碱基为A或G,scdA基因在混合培养中的相对表达量都显著高于单独培养中的表达量。测序结果表明整个培养过程中scdA基因型保持不变,而两种培养环境下金黄色葡萄球菌scdA基因相对表达量的变化反映了表型的差异。为了应对环境压力,金黄色葡萄球菌SNP251050对应的scdA基因在混合培养环境下显著提高了表达量,以维持自身在培养体系中的稳定性。这表明金黄色葡萄球菌能够依据环境变化在广义生理表型方面主动做出对环境信号的多样性响应,也可认为是金黄色葡萄球菌表型可塑性在环境变化下的反映。     

常压室温等离子体快速诱变绿色糖单孢菌筛选 木聚糖酶高产菌株及其酶学性质研究

[目的]利用常压室温等离子体快速诱变绿色糖单孢菌,筛选耐热耐碱木聚糖酶高产菌株,并对其进行酶学性质分析,确保其适用于生物制浆漂白工艺.[方法]采用刚果红平板水解圈法结合摇瓶发酵胞外酶测定法进行菌株筛选,并通过DNS木聚糖酶活性测定等方法对来源于不同突变株的木聚糖酶进行酶学性质分析对比.[结果]筛选出遗传稳定性良好的两株木聚糖酶高产菌株AT24和AT22-2,以麦草浆为诱导底物的粗酶液中,突变株AT24及AT22-2所产的木聚糖酶活性分别为512.74、552.70U/mL,分别为原始菌株S.v的16和17倍的.来源于突变株AT22-2的木聚糖酶的最适反应pH为9.5,最适反应温度为90℃,在50℃-90℃温度范围内具有良好的热稳定性,在100℃条件下处理30 min剩余酶活仍为68％;突变株AT24所产木聚糖酶的最适反应温度为60℃,最适pH为10.0,在60℃-80℃的高温环境下,突变株AT24所产的木聚糖酶具有良好的热稳定性.[结论]突变株AT22-2所产具有耐碱耐高温性质的木聚糖酶,在应用领域尤其在纸浆造纸行业具有较大的潜在应用价值.     

噬菌体鸡尾酒对猕猴桃溃疡病的田间防治效果及叶际细菌群落结构的影响

【背景】噬菌体鸡尾酒可作为一种杀灭猕猴桃溃疡病病原菌(Pseudomonassyringaepv.actinidiae, Psa)的生物制剂,但关于噬菌体鸡尾酒在田间的防治效果和对猕猴桃植株叶际内生细菌群落结构影响的研究依然较少。【目的】探究噬菌体鸡尾酒在田间防控猕猴桃溃疡病的效果,以及噬菌体鸡尾酒对猕猴桃茎内叶际细菌微生态的影响。【方法】使用猕猴桃溃疡病病原菌感染健康植株,对比施用噬菌体鸡尾酒和传统铜制剂后溃疡病的发病情况,利用高通量测序技术分析猕猴桃叶际内生细菌群落结构的变化。【结果】与铜制剂相比,噬菌体鸡尾酒可更有效地控制猕猴桃溃疡病,改变叶际细菌群落的丰富度与多样性,增强群落结构的稳定性,改善群落物种功能基因丰度情况,一定程度使叶际细菌群落恢复至健康状态。【结论】噬菌体鸡尾酒在杀灭病原菌的同时具有良好的微生态调节功能,在猕猴桃溃疡病的生物防治中具有巨大的应用潜力。     

灰色链霉菌中乙酰木聚糖酯酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

根据Gen Bank数据库中已报道的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)全基因组序列,分析得到假定的乙酰木聚糖酯酶基因序列并设计引物;利用分子克隆的方法得到该菌株基因组中乙酰木聚糖酯酶基因,并构建原核表达载体p ET28a-Sgraxe,经IPTG诱导表达重组Sgr Axe,Ni-NTA亲和层析法纯化该蛋白。结果显示,克隆得到乙酰木聚糖酯酶基因axe,其序列全长1 008 bp,编码336个氨基酸。SDS-PAGE检测带有p ET28a-Sgraxe转化菌株诱导表达产物相对分子量约为37 k D,与理论值相符。纯化的重组Sgr Axe酶学性质表明,该酶最适反应温度为50℃,最适p H8.0,热稳定性较强,p H作用范围广;金属离子对酶均表现为抑制作用,尤其是Zn2+严重抑制酶活力;重组酶特征的分析揭示了其在工业中潜在的应用价值。     

功能作图(functional mapping)分析大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之间的竞争互作

【背景】功能作图(functionalmapping)模型是基于统计方法的分析生物体动态复杂性状发育的全基因组作图方法,旨在定位性状发育过程中的数量性状位点(quantitative trait loci, QTL),将功能作图应用于微生物研究有助于解析复杂的互作过程。【目的】利用功能作图定位两种微生物在动态生长发育过程中发挥显著作用的QTL,通过基因功能注释找到影响微生物表型生长的基因。【方法】将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各100个菌株单独培养和一一配对共同培养,将取得的各菌株生长丰度表型数据和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)数据进行关联分析,找到同一物种在不同培养条件下对生长起作用的显著QTL。【结果】通过功能作图分析,在大肠杆菌中定位到217个QTL,金黄色葡萄球菌中定位到152个QTL;通过功能聚类和基因注释分析发现,QTL所在候选基因中金黄色葡萄球菌scdA、sdrC、sdrD、ftsA和大肠杆菌phr、nagC、eptA、ppsA、priA、flim基因对微生物的生长发挥了较大作用。【结论】本文借助功能作图定位了大肠杆菌和金黄...