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【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。 相似文献
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目的:研究异甘草素-β-环糊精包合物(isoliquiritigenin-β-cyclodextrin complex,ISL-β-CD Complex)对Ⅱ型胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠体重、血清氧化指标、关节滑膜细胞凋亡及关节滑膜中细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达的影响,进一步探讨ISL-β-CD包合物治疗CIA模型大鼠的机制.方法:将四周龄雄性SD大鼠分为6组,空白对照组、模型对照组,雷公藤多苷片组(100 mg·kg1)和3个不同剂量的ISL-β-CD组(100 mg·kg1,400 mg·kg-1,800 mg·kg-1),除空白对照组,其余5组建立CIA模型,自加强免疫第二天灌胃给药4周,每周测量大鼠体重,末次给药后取血和关节滑膜,检测血清中氧化指标超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平,TUNEL计算关节滑膜细胞凋亡、western blot检测滑膜细胞中cyclin D1的表达.结果:与模型对照组相比,ISL-β-CD能改善类风湿性关节炎带来的体重降低(P＜0.05),降低大鼠血清中SOD水平(P＜0.05),升高MDA水平(P＜0.05);药物治疗组的细胞凋亡率高于模型对照组;但经过药物治疗后,滑膜中cyclin D1的水平没有降低.结论:ISL-β-CD包合物可促进细胞凋亡改善RA症状而不是通过作用于cyclinD1降低细胞过度增殖改善RA症状.ISL-β-CD包合物可作为治疗RA的潜在药物进一步被开发研究而其作用于RA的机制有待进一步探讨. 相似文献
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