蔗糖富集环境中蔗糖磷酸化酶的酶学性质研究与改造

【背景】蔗糖富集土壤是蔗糖磷酸化酶的重要来源之一。此酶能以较廉价的蔗糖为底物进行转葡萄糖基反应,改善受体底物的理化性质,因而具有重要的应用价值。【目的】研究蔗糖富集土壤中蔗糖磷酸化酶的酶学性质和转糖苷活性,为其更优质的改造提供材料和理论基础。【方法】将宏基因组中获得的蔗糖磷酸化酶基因克隆到表达载体上构建重组大肠杆菌,诱导表达并进行镍亲和层析纯化蛋白。以蔗糖为底物测量重组酶的基本酶学性质,研究其对糖类底物的转糖苷活性。通过底物通道分析,利用反向PCR技术对其第155位点进行饱和突变,并测定突变体基本酶学性质和转糖苷活性。【结果】纯化的酶蛋白分子量大小约为56 kD,活性状态时以三聚体形式存在。在以蔗糖为底物时,最适温度和最适pH值分别为55°C和6.5;Km和Vmax值分别为23.1±2.4 mmol/L和407.9±8.5μmol/(mg·min),对第155位点进行了定点饱和突变,获得了部分酶学性质或转糖苷活性改善的突变体。【结论】宏基因组中蔗糖磷酸化酶的研究丰富了酶学数据,并通过分子改造获得了部分性质更优的突变体,为转糖苷活性关键氨基酸的研究和该酶的工业应用奠定了基础。     

阴沟肠杆菌GX-3的中性蔗糖酶在大肠杆菌中的表达及其特性鉴定

【目的】在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)GX-3中发现了一个编码中性p H范围内起作用的蔗糖酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行克隆表达及纯化,并研究该蔗糖酶的酶学性质,为蔗糖酶的应用研究及开发利用奠定基础。【方法】通过查找Gen Bank数据库中来自阴沟肠杆菌同属中的编码蔗糖酶的基因序列,对这些序列进行比对分析设计简并引物扩增保守区;利用PCR扩增目的基因,以p QE30为表达载体构建重组质粒;镍亲和层析纯化重组蛋白,对重组酶的酶学性质进行详细研究。【结果】一个编码蔗糖酶的基因(Einv)被从阴沟肠杆菌GX-3中发现和克隆。生物化学特性鉴定表明这个蔗糖酶的活性最适温度为40℃和最适p H为6.5。凝胶渗透色谱法分析显示Einv是以二聚体的形式存在。Einv这个蔗糖酶在1170 mmol/L的蔗糖条件下仍保留有80%以上的水解活性。而在高浓度的蔗糖条件下,Einv只有水解活性而没有转糖基的副反应发生。它能够水解棉子糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和水苏糖。【结论】获得的Einv是一个在中性p H范围内起作用的β-呋喃果糖苷酶,只有水解功能而没有转糖基功能。这些特性表明这个中性蔗糖酶在食品工业具有重要的应用价值。