噬菌体整合酶介导的位点特异性基因治疗

将治疗基因整合到患染色体上的特定位点并实现稳定的表达是基因治疗的关键,包括病毒载体和转座子系统在内的几种技术已经用于整合,但都存在治疗基因负载力较小及随机整合的应用障碍。来自链霉菌噬菌体中C31、R4及来自乳酸乳球菌噬菌体TP901-1的整合酶,能够识别有限数量的天然基因组序列(假att位点)．从而催化治疗基因位点特异性地整合进入高等真核生物基因组。这种新型的噬菌体整合酶系统在基因负载力及染色体的特异性整合方面具有很大的优越性。迄今为止,这种系统已经成功用于几种基因治疗的研究模型中．将会成为基因治疗的有用工具。     

高致病性2型猪链球菌plcR基因敲除株的构建及其相关生物学特性的研究

【目的】构建高致病性2型猪链球菌05ZYH33菌株plcR基因敲除株,通过比较突变株与野生株生物学特性的差异,研究plcR基因在2型猪链球菌致病过程中的作用。【方法】利用同源重组技术敲除plcR基因,多重交叉PCR及RT-PCR鉴定并测序验证。比较野生株与突变株基本生物学特性的差异,小鼠攻毒实验分析plcR基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】经RT-PCR证实05SSU0241与05SSU0242共转录,通过多重交叉PCR及RT-PCR证实成功构建plcR基因缺失突变株,基本生物学特性显示突变株的生长速率、菌落形态、溶血活性均无显著改变,小鼠致病性试验结果显示,野生株攻毒的小鼠死亡率为70%,突变株攻毒的小鼠死亡率为40%,毒力较野生株显著降低。【结论】plcR基因作为2型猪链球菌有毒株基因组中特有的外源基因,在细菌致病过程中具有重要作用。     

噬病毒体

噬病毒体是一种能感染其它病毒,通过损害宿主病毒来完成自我复制的病毒。目前已经先后发现三种噬病毒体:Sputnik、Mavirus和OLV(有机湖噬病毒体)。大多数噬病毒体都在低级的生命形式如阿米巴变形虫中被发现。噬病毒体能抑制宿主病毒的增殖和裂解细胞的能力,并且噬病毒体只有在宿主病毒存在时才能增殖。噬病毒体的发现开启了一条新的探索病毒间相互作用的途径。本文主要就噬病毒体的发现过程、噬病毒体的基本特征及噬病毒体感染宿主病毒的机制进行概述。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的分离与鉴定

[目的]鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的生物学特性.[方法]双层琼脂培养法制备PaP4的单个噬斑,观察噬斑特点;用聚乙二醇8000浓缩PaP4颗粒后,再用氯化铯密度梯度离心纯化;用透射电子显微镜观察磷钨酸负染色的PaP4颗粒;提取PaP4基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,充分裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌,进行一步生长实验,绘制一步生长曲线.[结果]PaP4的噬斑直径约3 mm-5 mm,圆形透明边缘清晰;PaP4噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约50 nm,有一个约30 nm的短尾;限制性酶切实验表明PaP4基因组为双链DNA;当MOI为0.001时PaP4感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;用一步生长曲线描绘了其生长特性.[结论]PaP4属dsDNA短尾科裂解性噬菌体;最佳感染复数是0.001;由一步生长曲线得出感染宿主菌的潜伏期是25 min,裂解期是20 min,平均裂解量是150.     

高致病性2型猪链球菌IV型样分泌系统virB1-89K基因的敲除及其对毒力的影响

摘要:【目的】构建高致病性2 型猪链球菌IV 型样分泌系统virB1-89K基因的敲除株和互补株,研究virB1-89K基因缺失对细菌毒力的影响。【方法】通过同源重组技术敲除virB1-89K基因,多重PCR筛选敲除株并测序鉴定。再将virB1-89K基因克隆到穿梭质粒pSET1后转入virB1-89K敲除株中,构建互补株。比较野生株05 ZYH33、突变株△virB1-89K和互补株CvirB1-89K三者基本生物学特性的差异,小鼠实验分析virB1-89K基因敲除后对细菌毒力的影响。【结果】成功构建突变株△virB1-89K和互补株CvirB1-89K,在基本生物学性状无明显改变的情况下,敲除株的毒性降低到野生株的30%,互补株可恢复其毒性。【结论】virB1-89K基因作为2型猪链球菌高致病性菌株05 ZYH33的IV样分泌 系统的重要组分,与其高致病性密切相关。     

高致病性2型猪链球菌Ⅳ型样分泌系统virB1-89K基因的敲除及其对毒力的影响

[目的]构建高致病性2型猪链球菌Ⅳ型样分泌系统vir B1-89K基因的敲除株和互补株,研究vir B1-89K基因缺失对细菌毒力的影响.[方法]通过同源重组技术敲除vir B1-89K基因,多重PCR筛选敲除株并测序鉴定.再将virB1-89K基因克隆到穿梭质粒pSET1后转入vir B1-89K敲除株中,构建互补株.比较野生株05ZYH33、突变株△virB1-89K和互补株CvirB1-89K三者基本生物学特性的差异,小鼠实验分析virB1-89K基因敲除后对细菌毒力的影响.[结果]成功构建突变株△vir B1-89K和互补株CvirB1-89K,在基本生物学性状无明显改变的情况下,敲除株的毒性降低到野生株的30％,互补株可恢复其毒性.[结论]virB1-89K基因作为2型猪链球菌高致病性菌株05ZYH33的Ⅳ样分泌系统的重要组分,与其高致病性密切相关.     

噬菌体编码的抑菌蛋白

噬菌体是细菌的天敌,它利用宿主的细胞机制完成自身的复制。在感染过程中噬菌体基因组进入细菌细胞后立即产生调节或重新定向宿主特定功能的蛋白质(即抑菌蛋白),以逃避多种细菌的防御机制或改变宿主的分子代谢机制。研究发现,这些噬菌体编码的抑菌蛋白可抑制细菌分裂,干扰细菌遗传物质的复制、转录及降解,影响CRISPR介导的细菌免疫以及代谢。明确噬菌体编码的抑菌蛋白如何影响这些宿主的防御或分子代谢机制可以优化目前基于噬菌体的抗菌策略,找出控制细菌感染的新途径,为抑菌药物的发现和设计打开新的大门。本文就近年来发现的噬菌体编码的抑菌蛋白及其抑菌机制的研究进展进行综述。     

研究生“医学分子微生物学”优质课程建设与实践

针对医学院校研究生创新教育的需求,结合"医学分子微生物学"优质课程建设,阐述在教学团队、教学内容、教材及网络资源等方面的改革与实践效果,为同类课程建设提供借鉴。     

重组人肽抗生素hPAB—β及其突变体的活性测定与筛选

从人体基因组中克隆了一个编码肽抗生素样的基因。按基因编码产物的氨基酸序列 ,化学合成目的产物 ,药物敏感测定法证实产物具有杀菌活性后 ,又用基因工程法人工表达了目的产物。测定表达的重组人肽抗生素hPAB β及其突变体的抗菌活性 ,筛选理想的活性分子。方法是应用平板法和最小抑菌浓度 (MinimumInhibitionConceng tration ,MIC)测定法检测重组表达的hPAB β及突变体hPAB β38,hPAB β34对 8株实验室保存菌株及 10株临床分离菌株的杀菌能力 ,并以化学合成的肽抗生素hPAB β作对照 ;根据各目的分子抗菌能力的强弱 ,筛选理想的目…     

高致病性2型猪链球菌截短型类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因的鉴定和功能研究

【目的】克隆表达高致病性2型猪链球菌05ZYH33株的SspA截短型基因,验证其是否具有酶学活性,并构建该基因的缺失突变株细菌,探讨其在2型猪链球菌致病过程中所起的作用【。方法】构建SS2的SspA截短型基因05SSU0811原核表达质粒,表达并纯化05SSU0811蛋白,运用丝氨酸蛋白酶底物Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pNa),通过显色反应检测表达产物的酶学活性;运用同源重组技术敲除05SSU0811基因,多重交叉PCR筛选敲除株并测序鉴定,动物试验分析05SSU0811基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】成功表达并纯化05SSU0811蛋白,浓度约为3.5 g/L。丝氨酸蛋白酶活性测定试验证实其具有酶学活性;获得05SSU0811基因缺失突变株,小鼠攻毒试验表明,野生株攻毒的20只小鼠全部死亡,基因缺失突变株攻毒组死亡9只,死亡率45%,两组间死亡率有显著性差异。表明05SSU0811基因缺失的菌株毒力较野生株明显下降。【结论】05SSU0811基因编码的截短型丝氨酸蛋白酶仍然具有酶学活性,SS2的截短型基因SspA在高致病性2型猪链球菌的致病性方面具有一定作用。