酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。     

小麦转录因子TaWRKY74-c和TaWRKY74-d基因的克隆及基于生物信息学的功能分析

WRKY基因是近年来研究较为广泛的植物转录因子,目前许多物种中都克隆出WRKY基因。近年来,小麦中也有WRKY基因被克隆,但是由于对WRKY基因生物信息学分析不足,导致研究带有一定的盲目性。本试验以小麦品种扬麦158叶片为材料,分离了2个WRKY基因,分别编码344个和371个氨基酸,与GenBank数据库中的TaWRKY74基因高度同源,命名为TaWRKY74-c和TaWRKY74-d。蛋白质保守结构域分析表明,2个基因都含有1个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子家族。定量PCR分析表明TaWRKY74-c和TaWRKY74-d在小麦的叶片、花和茎中均表达,且在茎中的表达量最多,在花中的表达量最少。采用Genevestigator转录组分析工具,对基因在331种环境条件(如逆境、病害、激素等刺激)、10个发育时期(如苗期、孕穗期等)和21种组织器官(如根、花、叶等)中的表达进行了分析,结果表明,该基因在小麦不同发育时期和组织器官中都有表达,且在植物遭受低温、病原体侵染等环境因子处理下,表达量发生显著改变,预示可能参与到这些生物学过程中。采用RT-PCR的方法对上述分析结果进行验证,结果表明生物学实验与生物信息学预测的结果一致。本研究将大量小麦转录组的数据应用到WRKY基因功能分析上,深化了对小麦WRKY基因家族成员功能的认识,为今后对该基因的表达分析和功能研究提供了重要线索和方向。     

小麦杂交种与亲本发育早期种子的基因表达差异及其与杂种优势关系的初步研究

为深入探讨小麦杂种优势形成的分子机理,选取3个冬小麦品种(系)为一组亲本,3个为另一组亲本,配制了正反交18个杂交组合,以授粉后6d的杂交和自交种子为材料,应用mRNA差异显示技术(DDRT—PCR)研究了小麦杂交当代种子与其亲本自交种子基因的表达差异,并与杂种优势进行相关分析。为降低DDRT—PCR技术假阳性的不利影响,对每个引物组合均作了两次PCR扩增,在处理数据时,仅统计能重复出现的条带。结果发现：杂交种和亲本之间的基因表达模式有8类共15种：(1)单亲沉默型(2种),(2)单亲一致型(2种),(3)正交或反交沉默型(2种),(4)正交或反交特异型(2种),(5)正交或反交单亲一致型(4种),(6)杂交种特异型(1种),(7)双亲共沉默型(1种),(8)表达一致型(1种)。分析发现,小麦杂交种和亲本间存在显著的表达差异。在差异表达类型中,杂交种特异型和双亲共沉默型比例最低。对上述15种表达模式与杂种优势进行相关分析,结果表明,表达一致型与各产量性状杂种优势之间的相关均不显著,说明杂种优势是由某些有表达差异的基因造成。9个产量性状均能检测到一种以上与其显著或极显著相关的基因表达模式,有些性状受正负相关效应的共同影响;沉默型(包括单亲沉默型、正交或反交沉默型和双亲共沉默型)和正交或反交单亲一致型在杂种优势形成中发挥重要作用。这些研究表明,在种子发育早期,基因的差异表达与杂种优势形成之间可能存在较为复杂的关系。     

茉莉酸甲酯诱导保卫细胞气孔关闭的信号转导机制

气孔是由植物器官表面成对的保卫细胞围成的小孔,气孔运动控制气体交换,与植物逆境应答和生长发育等生物学过程密切相关,受多种因子调控,茉莉酸甲酯(MeJA)是其中之一。与ABA类似,MeJA也可诱导气孔关闭,但是其机理尚不清楚。该文综述了近年来MeJA调控气孔运动的信号转导机制进展,包括Ca2+、胞质pH、活性氧和NO等第二信使对气孔开闭的影响以及COI1、JAR1、RCN1和TGG1/2等信号组分之间的调控关系,并讨论了保卫细胞中MeJA与ABA信号途径的相互作用。     

控制基因盐诱导且根系优势表达的小麦启动子Tasipro3克隆及功能分析

在土壤盐胁迫下,小麦根系吸收水分和营养物质的功能受到抑制,从而影响植株的经济产量。因而,开展小麦耐盐育种,提高根系耐盐性是重要途径之一。使耐盐基因在根系中优势表达,并且在盐胁迫下增强表达,将显著提高根系耐盐性。而克隆和鉴定具有双重控制功能的启动子,是实现耐盐基因精准调控的基础。鉴于此,本研究利用Genevestigator在线生物信息学分析软件,筛选到425个盐诱导根系优势表达的探针,并从中选出2个候选探针,用于启动子验证。以1周龄小麦品种中国春的幼苗为材料,将其根系置于200 mmol/L的NaCl溶液中,分别于0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h和8 h进行根系取样,用于表达模式分析。结果表明,Ta.5463.1.A1_at探针的基因表达模式更符合生物信息学预测的结果,受盐胁迫诱导表达显著上调,且基因优势表达于根系。为进一步验证相应基因启动子的功能,对此探针对应的启动子区进行了克隆,并连接到启动子验证载体中,遗传转化获得转基因拟南芥植株。盐诱导后GUS染色的实验结果表明,该启动子使GUS报告基因在盐处理下表达量显著提高,且主要在根系表达。本研究成功克隆了耐盐遗传改良专用启动子,为小麦分子抗逆育种提供了优异资源。     

桥本氏病合并甲状腺乳头状癌患者血清甲状腺相关激素水平的变化及意义

目的:探究桥本氏病(HT)合并甲状腺乳头状癌(PTC)患者血清甲状腺相关激素水平的变化及意义。方法:对我院148例HT患者的临床资料进行回顾性分析,根据其是否合并PTC分为HT合并PTC组(n=68)和单纯HT组(n=80)。比较两组患者性别、年龄及血清促甲状腺激素(TSH)、甲状腺功能指标[游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)]、抗甲状腺抗体[甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧物酶抗体(TPOAb)]水平等临床资料差异,分析血清TSH水平变化及意义。结果:HT合并PTC组患者男性比例、年龄、病程及血清TSH水平均大于单纯HT组,血清TGAb、TPOAb水平则均小于单纯HT组(P0.05);血清FT3、FT4水平比较差异无统计学意义(P0.05)。HT合并PTC患者组血清TSH4.2 m IU/L患者占比高于血清TSH正常组(P0.05)。血清TSH4.2 m IU/L患者中HT合并PTC患者的占比大于血清TSH水平正常的患者(P0.05)。HT合并PTC患者中,血清TSH水平4.2 m IU/L患者中央区淋巴结转移发生率高于血清TSH水平正常患者(P0.05);血清TSH4.2 m IU/L与血清TSH正常患者多灶癌发生率比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:HT患者血清TSH水平升高可能促进其甲状腺组织癌变,HT合并PTC患者血清TSH水平升高可能促进其中央区淋巴结转移。     

生长素调控植物气孔发育的研究进展

气孔是分布于植物表皮由保卫细胞围成的小孔, 是植物体与外界环境进行水分和气体交换的重要通道, 通过影响光合作用、蒸腾作用及一系列生物学过程来促进植物适应环境的变化。生长素是最早被发现的植物激素, 在植物生长发育中发挥重要作用。近年来的研究表明, 生长素通过载体蛋白-TIR1/AFB受体-AUXIN/IAA-ARFs信号通路, 调控STOMAGEN的表达; 之后, 经STOMAGEN-类LRR受体蛋白激酶ERf-MAPKs级联反应激酶-SPCH转录因子信号通路, 启动气孔的发育进程。EPF1、EPF2和类LRR受体蛋白激酶TMM不是该过程的必需元件。生长素对气孔的调控受光信号影响, 光信号通路组分E3泛素连接酶COP1位于MAPKs激酶的上游, 参与气孔的发育调控。     

低空气湿度下气孔运动的调控

植物气孔应答气候环境因子的机制,一直是植物抗逆生理研究领域的热点课题。空气湿度是主要的气候环境因子之一,人们很早就发现降低空气湿度能导致气孔开度变小,但到目前为止,对调控这一生物学过程的机制还知之甚少。本文概述近年来在植物气孔应答低空气湿度信号的运动规律、水被动反馈假说、水主动反馈假说、水力调节与代谢调节的关系等方面的进展,并基于进化学的理论,提出了水力调节和代谢调节的反向消长模式,以期解释大量物种气孔对低空气湿度的不同应答反应。