用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源。采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点。因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节。为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台——Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率。研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率。因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法。     

Notch信号通路与血液系统和白血病形成

Notch基因编码着一类进化上高度保守的跨膜受体蛋白家族,其信号通路是由Notch受体、Notch配体、CSL DNA结合蛋白组成。该信号通路能够调节淋巴细胞的发育和分化过程,介导心血管系统的形成,参与肿瘤的发生和发展。近年来有研究表明,Notch信号通路在造血作用及白血病的发生过程中起关键作用。本文综述了Notch信号通路在淋巴细胞及造血干细胞的发育和分化中的作用,进一步探讨了其对造血作用和白血病发生发展的调节,以期能够对临床造血疾病的治疗提供帮助。     

氧化苦参碱对骨髓来源细胞生长的双向调节作用

目的:观察氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对骨髓来源细胞增殖的影响.方法:应用MTr比色法、流式细胞仪检测法、集落形成法和免疫细胞活性测定等方法,检测OMT对白血病细胞K562的抑制作用;骨髓造血干细胞的集落形成实验和脾细胞对肿瘤细胞的杀伤的生物活性试验,检测OMT对小鼠免疫和造血的影响.结果:(1)不同浓度的OMT可明显抑制白血病细胞K562细胞的增殖、集落形成,导致细胞凋亡(P＜0.05),且作用呈浓度依赖性.(2)OMT可以促进小鼠骨髓粒系造血,且在0.2475 mg/mL时达到峰值.(3)OMT可抑制小鼠的免疫功能.结论:OMT可抑制白血病K562细胞的增殖并诱导其凋亡,同时抑制小鼠的免疫功能,促进小鼠骨髓CFU-GM的形成,表现出对骨髓来源细胞生长的双向调节作用.     

钙离子浓度对光暗适应罗氏沼虾感光细胞可溶性Gq蛋白α亚基的影响

以光适应和暗适应条件下的罗氏沼虾复眼视网膜为材料,分别用高钙溶液、生理溶液、低钙溶液孵育后,用蛋白质提取液提取可溶性Gq蛋白α亚基并SDS-PAGE电泳,利用Tanon GIS凝胶图像处理系统分析其含量。从光暗条件下3种溶液孵育后的感光细胞中都提取到了42kDa的可溶性Gq蛋白α亚基。高钙溶液、生理溶液、低钙溶液孵育后的感光细胞中可溶性Gq蛋白α亚基的含量,光适应组分别是3．13％、3．09％、3．03％;暗适应组分别是3．17％、3．06％、3．0l％。在生理溶液和低钙溶液中,该蛋白含量光适应组大于暗适应组,但低钙溶液的光适应组与暗适应组无显著差异;在高钙溶液中,暗适应组显著大于光适应组,可能与钙离子反馈调节作用有关。     

凡纳滨对虾不同组织内SOD、POD酶的细胞化学定位

运用电镜酶细胞化学技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内肝脏、肌肉、心脏、复眼和鳃等5种组织的SOD和POD酶的细胞化学定位进行了研究,并与感染病毒的凡纳滨对虾体内5种组织中SOD和POD的细胞化学定位进行比较。结果显示,在健康对虾体内,SOD酶阳性反应颗粒主要定位于肌肉、心脏、肝脏和鳃等组织细胞的线粒体膜、细胞质中,以及肝细胞的脂滴周围;POD酶主要定位于心脏、鳃和肝脏组织细胞的过氧化物酶体内,肝细胞中脂滴周围也有POD的阳性反应颗粒。感染病毒后,各组织细胞表现出明显的病理性结构变化,大量的髓样小体出现,脂滴数量明显减少。同时各组织中SOD和POD酶的细胞化学定位也发生了明显的变化,表现为心脏、鳃、肌肉组织细胞胞质中的SOD阳性颗粒消失,肝细胞中的SOD阳性颗粒明显减少,在心脏和鳃的线粒体基质内也出现SOD阳性颗粒;POD仍主要定位在过氧化物酶体中,但心脏中的过氧化物酶体解体而有许多呈阳性反应的小颗粒分布在细胞质中。结果表明SOD和POD在凡纳滨对虾防御氧的毒性损伤以及整个机体的免疫功能等方面起着重要的作用。       

Aβ_(25～35)和人参皂苷Rb1对鼠神经干细胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A表达的影响

目的:研究大鼠神经干细胞诱导分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达以及Aβ25～35和人参皂苷Rb1的调节作用。方法:取新生SD大鼠的海马组织体外培养获得NSCs,诱导第3代的NSCs向神经细胞分化1周后,免疫荧光细胞化学染色检测活化型GSK-3β(pTyr279,216)和蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)的表达及Aβ25～35和人参皂苷Rb1对它们的影响;RT-PCR分析糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、细胞周期依赖性蛋白激酶-5(CDK-5)和蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)的mRNA表达以及Aβ25～35和人参皂苷Rb1的影响。结果:免疫荧光细胞化学染色显示:NSCs诱导分化1周后有活化型GSK-3β(pTyr279,216)和PP2A的表达,Aβ25～35能增强GSK-3β(pTyr279,216)的表达同时抑制PP2A的表达,而人参皂苷Rb1则能逆转Aβ25～35的作用;RT-PCR检测发现:NSCs诱导分化1周后表达GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA,使用Aβ25～35处理后GSK-3β、CDK-5的表达增强而PP2A的表达减弱,用人参皂苷Rb1预处理神经干细胞后Aβ25～35的作用受到抑制。结论:体外培养的神经干细胞分化后表达GSK-3β、CDK-5和PP2A,并受Aβ25～35和人参皂苷Rb1的调节,提示在体外由神经干细胞分化的细胞具备正常神经细胞的蛋白磷酸化调节系统。     

经大豆DNA溶液处理的水稻后代种子的粗蛋白和氨基酸含量分析初报

以大豆为外源DNA供体,用浸种及幼苗期浇灌法和花粉管通道法直接将大豆总DNA导入受体水稻,经常规栽培获得水稻后代种子。采用微量凯氏定氮法和氨基酸自动分析仪进行水稻后代种子糙米的粗蛋白含量和氨基酸含量的测定。结果显示:三组经大豆DNA溶液处理获得的水稻后代种子糙米粗蛋白平均含量分别为16.42%、16.80%和19.87%,与对照组相比有明显提高,统计分析都达到极显著的差异(P < 0.01);在氨基酸含量测定中,有些材料的总氨基酸(除色氨酸以外)含量高达17.20%、16.86%和16.09%,其中赖氨酸的含量分别为0.60%、0.60%和0.57%,与对照组相比也有明显提高,统计分析差异也都达到极显著水平(P < 0.01)。本试验结果充分说明,利用大豆总DNA的导入方法有可能达到迅速有效地提高稻米蛋白质及赖氨酸含量的目的。     

噬菌体展示重组人淋巴毒素突变体库及受体亲和筛选

淋巴毒素 (lymphotoxin , LT) 通过 TNFR1 受体传递凋亡信号,从而发挥抗肿瘤活性 . 对 LT 的受体结合区域进行多点随机突变,利用噬菌体展示重组人淋巴毒素 (rhLT) R46 , S106 , L130 三点随机突变组合文库和 S106 ～ F110 区域随机突变体库 . 噬菌体库与固相化 TNFR1 受体进行亲和筛选,富集了能与 TNFR1 受体结合的 rhLT 突变体 . 随机挑选 20 个单克隆噬菌体进行 ELISA 受体结合鉴定,其中 80 ％的克隆与 TNFR1 受体特异性结合,有 4 个克隆与 TNFR1 受体的结合能力高于野生型序列的 rhLT. 将这 4 个结合力高的突变体克隆于 pET32a(+) 载体,经过大肠杆菌表达和纯化操作后,检测这些突变体蛋白与 TNFR1 受体的结合活性和对 L929 细胞的杀伤活性,发现 3 个克隆的受体结合性质与其展示于噬菌体上时基本吻合,其中 C199 克隆与 TNFR1 的结合活性比野生型序列的 rhLT 提高了近 30 ％,且其对 L929 细胞的杀伤活性提高了近 90%. 应用噬菌体展示技术对淋巴毒素进行体外进化研究的尝试,为下一步的蛋白质结构和功能研究提供了思路,可成为大分子药物开发的有效工具 .     

柚皮素自微乳不对称膜渗透泵胶囊的制备及体外评价

制备柚皮素自微乳不对称膜渗透泵胶囊并考察其体外释药行为。实验利用球晶技术进行自微乳的固化研究,以醋酸纤维素浓度、栓模浸入聚合物溶液中时间、栓模浸入淬火液中时间为自变量,采用星点设计-效应面优化法,以囊壳厚度和24h药物累积释放度为因变量,确定不对称膜渗透泵胶囊壳的最佳制备工艺。其最佳制备工艺为:醋酸纤维素浓度9.44%,栓模浸入聚合物溶液中时间3.77min,栓模浸入淬火液中时间15.86min,按最佳工艺得到的药物累积释放度为96.27%,囊壳厚度为0.275mm。体外释药行为符合零级释药方程(R=0.9997)。柚皮素自微乳不对称膜渗透泵胶囊可有效控制药物缓慢释放,解决难溶性药物制成渗透泵制剂释药不完全的问题。     

黄瓜花叶病毒山东株(CMV-SD)RNA2全长cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶＳＤＲＮＡ２的５’和３’末端序列,在此基础上,利用ＲＴＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２Ｆ。通过对ｐＣ２５和ｐＣ２３进行序列测定,得到了ＲＮＡ２的全序列。序列分析结果表明ＣＭＶＳＤＲＮＡ２由３０４８ｎｔ组成,其中存在２个部分重叠的阅读框ＯＲＦ１（７９～２６５２ｎｔ）和ＯＲＦ２（２４１４～２７４６ｎｔ）,分别编码８５８ａａ的２ａ蛋白和１１１ａａ的２ｂ蛋白,并在２ａ蛋白的序列中发现了动植物病毒复制酶所特有的两个保守序列。该株系ＲＮＡ２核苷酸序列与分属ＣＭＶＩ亚组的Ｆｎｙ株系和ＩＩ亚组的Ｑ株系ＲＮＡ２的核苷酸序列同源性分别为９１７％和７５６％;２ａ蛋白的氨基酸序列同源性分别为９３８％和６７７％,２ｂ蛋白的氨基酸序列同源性分别为８３０％和５１３％。同源性比较的结果表明ＳＤ株系属于ＣＭＶＩ亚组。