茎瘤固氮根瘤菌ORS571 GGDEF和EAL结构域蛋白的预测及功能研究

[目的]环二鸟苷酸c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使,能够调控多种细胞功能。c-di-GMP的合成与水解分别由含有GGDEF结构域和EAL结构域的蛋白催化。本研究针对茎瘤固氮根瘤菌ORS571的GGDEF和EAL结构域相关蛋白进行基因组学分析,并对三个同时含有GGDEF和EAL结构域的蛋白（AZC_3085、AZC_3226和AZC_4658）进行功能研究。[方法]利用SMART数据库对含有GGDEF和EAL结构域的蛋白进行结构域预测。利用CLUSTALW程序对蛋白序列进行比较分析。通过同源重组的方法构建突变株,并对突变株的细胞运动能力、胞外多糖合成、生物膜形成及与豆科宿主的结瘤等表型进行测定。[结果]茎瘤固氮根瘤菌ORS571中一共存在37个GGDEF和EAL结构域蛋白。突变株△4658的运动能力较野生型有下降,但是其胞外多糖合成能力、生物膜形成能力和竞争性结瘤能力较野生型有提高。此外,实验结果表明突变株△4658的胞内c-di-GMP水平高于野生型。突变株△3085和△3226的各种表型与野生型相比没有明显差异。[结论]茎瘤固氮根瘤菌ORS571编码如此大数量的GGDEF和EAL结构域蛋白,表明c-di-GMP可能在其信号转导过程中起到非常重要的作用。同时具有GGDEF和EAL结构域的蛋白AZC_4658对茎瘤固氮根瘤菌ORS571的运动能力、胞外多糖合成、生物膜形成及与宿主的结瘤起到一定的调节作用。     

田菁根际促生菌的筛选及其促生耐盐效果

【目的】为探究盐生植物田菁及其根际功能微生物改良盐碱地的效果,本研究从黄河三角洲盐碱区田菁根际土壤中分离促生菌,并明确其耐盐促生效果。【方法】采用选择培养方法从田菁根际土壤中分离固氮菌、解磷菌以及解钾菌,并进行16S rRNA分子生物学鉴定。之后对菌株的耐盐及促生特性进行测定,筛选性状优良菌株进行玉米促生作用研究。【结果】共分离得到105株根际促生菌,其中N102兼具多种促生特性且耐盐性达15%。田菁种子发芽试验表明,N102可显著提高田菁发芽率(47%,P0.05)、芽长(48.5%,P0.05)和根长(60%,P0.05);玉米盆栽试验结果表明,N102对盐胁迫下玉米的株高、根长、叶绿素含量、地上部干重以及根干重具有显著的促进作用。经系统发育分析,N102与Enterobacter soli ATCC BAA-2102 (NR117547)序列相似度为99.30%,鉴定属于Enterobacter属。【结论】菌株N102具有多种植物促生耐盐特性,具有开发成有效促进盐碱地作物生长的微生物肥的良好前景。     

农杆菌介导转化小麦幼胚获得抗除草剂再生植株

采用农杆菌介导法转化小麦品种G54授粉10 d后的幼胚,经5‰和2‰ PPT筛选获得83株正常再生植株.PCR及Southern杂交检测证明其中8株再生苗为转bar基因植株,这些植株对除草剂Basta的抗性明显提高.实验结果还证明,高糖浓度的培养基对愈伤组织诱导、植株再生及生根都有显著的促进作用;在感染液和共培养基中添加乙酰丁香酮有利于转化株的筛选.     

茎瘤固氮根瘤菌ORS571鞭毛马达基因fliN与fliM的功能分析

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌ORS571中鞭毛马达蛋白FliN、FliM的编码基因分别缺失的突变体表型,初步探究其功能机理。【方法】本研究采用同源重组和三亲本接合转移的方法构建突变体,测定野生型及突变株的生长曲线、趋化性、胞外多糖的分泌、生物膜的形成及细胞絮凝等表型。【结果】三种菌株的生长速率基本无差,与野生型菌株相比突变株鞭毛结构丧失,趋化能力、分泌的胞外多糖和生物膜形成能力均下降,但相同时间内细胞絮凝程度比野生型明显。【结论】实验表明,鞭毛基因fliN、fliM对茎瘤固氮根瘤菌ORS571鞭毛的形成、趋化运动、胞外多糖的分泌、生物膜的形成及细胞絮凝能力等均有调控作用。     

Comparative genomic and protein sequence analyses of the chemotaxis system of Azorhizobium caulinodans北大核心CSCD

［Objective］ Azorhizobium caulinodans ORS571 can fix nitrogen not only as a free-living organism and an associative-symbiotic bacterium by colonizing the root surface of non-leguminous plants, but also as a symbiotic bacterium by interacting with leguminous plant Sesbania rostrata.Due to its ability to grow and fix nitrogen under three conditions, A.caulinodans uses sophisticated chemotaxis signal transduction systems to transform environmental cues into corresponding behavioral responses.Chemotaxis appears crucial for the growth of A.caulinodansin complicated environment and the construction of associative relationship with the plant.However, little is known about the chemotactic pathway of A.caulinodans.Thus, our study aimed to compare the chemotaxis-like genes of A.caulinodans with those of well-studied species.［Methods］ NCBI protein BLAST was used for searching sequence similarity with default parameter values against the genomes of A.caulinodans.HMMER3, based on Pfam database, was used for comparative analyses of methyl-accepting chemotaxis protein （MCP）.［Results］ There was a major chemotaxis cluster in A.caulinodans and the CheR methylated MCPs independently of pentapeptide motif.There were 43 MCP homologs containing diverse signal-sensing architectures in A.caulinodans.In addition,cytoplasmic domains of these MCPs were all composed of 38 heptad repeats.［Conclusion］ Despite the extremely high homology presented between the chemotactic system of A.caulinodans and those of well-studied species, A.caulinodans shows its own unique characteristics.The classification of these chemotactic pathways by comparative genomics enables us to better understand how A.caulinodansresponds to changes in environment via exquisite signal transductions in chemotaxis system.     

大麦虫及其肠道微生物对聚乙烯的生物降解

【背景】废旧塑料聚乙烯因具有较高的化学惰性,不易被自然降解而形成长期污染。【目的】探究聚乙烯泡沫塑料对大麦虫生长发育的影响,为大麦虫作为降解聚乙烯泡沫塑料的昆虫推广提供理论依据。【方法】以大麦虫幼虫为研究对象,选用常见的泡沫塑料(聚乙烯),采用4种不同的饲喂方式T1 (麦麸)、T2 (泡沫塑料)、T3 (泡沫塑料+麦麸)、T4 (不饲喂)进行驯化,处理30 d后对大麦虫进行解剖,取肠道内容物于LB培养基中进行富集培养,将富集培养后的菌液加入以聚乙烯(polyethylene,PE)为唯一碳源的LCFBM培养基进行选择性培养,从中筛选分离得到对PE塑料有降解能力的菌株。【结果】取食泡沫塑料30d后,与单一饲喂PE相比,麦麸和PE混合饲喂后大麦虫幼虫的存活率为76%。采用傅里叶变换红外光谱检测发现虫粪组分中主要官能团中峰值明显变化,表明PE长链有断裂现象,并从肠道中分离得到3株可以对PE薄膜边缘造成明显侵蚀的菌株。【结论】大麦虫可取食并消化PE塑料,其肠道内的微生物对PE塑料的降解起到关键作用,研究结果为塑料污染的生物降解提供了科学证据。     

细菌趋化信号通路中的磷酸酯酶CheZ

细菌通过趋化系统获得在复杂环境中的生存优势。趋化性在细菌致病性、病菌定殖、固氮细菌与宿主共生、植物与微生物互作等方面有重要的作用。作为趋化信号适应中不可或缺的调节蛋白,对CheZ的深入研究具有重要意义。本文主要对CheZ的结构、作用机制、功能调节、蛋白定位以及进化地位等方面的研究现状进行了综述,旨在为其它细菌中趋化系统的研究提供有益参考。     

北黄海沉积物可培养产蛋白酶细菌分离鉴定

【目的】揭示北黄海沉积物中可培养产胞外蛋白酶细菌及蛋白酶多样性,增加人们对北黄海生态系统中产蛋白酶菌多样性的认识,为海洋产蛋白酶微生物的挖掘提供菌群资源。【方法】分别将5个北黄海沉积物样品梯度稀释涂布至酪蛋白明胶筛选平板,选择性分离产蛋白酶细菌;并通过分析基于16S rRNA基因序列的系统发育关系,揭示这些细菌的分类地位和遗传多样性;分别测定胞外蛋白酶活性并对酶活较高的39株菌进行基于苯甲基磺酰氟(PMSF,丝氨酸蛋白酶抑制剂)、邻菲罗啉(o-phenanthroline,O-P,金属蛋白酶抑制剂)、E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)和pepstatin A(天冬氨酸蛋白酶抑制剂)4种抑制剂的酶活抑制实验以及所有菌株对3种底物(酪蛋白、明胶、弹性蛋白)的水解能力;分析这些细菌所产胞外蛋白酶的特性及多样性。【结果】从5个北黄海沉积物样品中分离获得66株产蛋白酶细菌,这些菌株隶属于Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes 4个门的7个属,其中Pseudoalteromonas(69.9%)、Sulfitobacter(12.1%)和Salegentibacter(10.6%)是优势菌群;沉积物中可培养的产蛋白酶细菌的丰度为104 CFU/g;蛋白酶酶活抑制实验表明所有测定菌株产生的胞外蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶,仅有少数菌株所产蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶活性。【结论】北黄海沉积物中可培养产蛋白酶细菌类群较为丰富,Pseudoalteromonas、Sulfitobacter和Salegentibacter菌株是优势菌群,测定菌株所产胞外蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶。     

高效解硅菌的分离鉴定及其促生能力

【背景】硅具有提高作物抗逆性、提高产量及改善品质的能力而被广泛报道,但传统施肥对硅肥的忽略使耕地土壤有效硅含量不断降低,因此建立高效提高土壤有效硅的方式尤为重要。【目的】土壤中有效硅的含量影响作物对硅的吸收利用,通过施用具有解硅能力的土壤微生物实现土壤有效硅的持续活化,不仅对作物产量和品质有重要意义,同时也可减少化肥的施用。【方法】利用选择培养基进行土壤解硅菌的富集、分离纯化,并测定其解硅能力、耐盐碱性、耐低氧性、解磷、解钾、解纤维素能力;利用孔雀绿染色及沙黄溶液复染法测定高效解硅菌芽孢形成率,最后通过盆栽试验探究高效解硅菌株对玉米的促生作用。【结果】筛选获得2株高效解硅菌,分别为菌株MB22及MB35-5,16S rRNA基因序列测定鉴定为Priestia aryabhattai。培养液有效硅浓度分别为空白处理的1.5倍和1.7倍,为对照菌株胶质类芽孢杆菌Paenibacillus mucilaginosus3016处理的1.1倍和1.2倍。2株高效解硅菌表现出较好的耐盐碱性,MB35-5功能最强,在pH 10.0、10% NaCl、10% KNO₃条件下培养液有效硅浓度为0.28-0.37 mmol/L。MB22和MB35-5产芽孢率分别为68%和55%,分别为对照菌株3016的1.69倍和1.37倍。MB35-5对磷、钾和纤维素都有一定的活化利用能力。盆栽试验表明,2株菌均显著提升了玉米株高及根系干重,其中MB35-5促生效果最好,平均株高是空白处理的1.39倍,是对照菌株3016处理的1.14倍,根系干重为空白处理的1.37倍,是对照菌株3016处理的1.24倍。【结论】筛选得到2株高效解硅菌MB22和MB35-5,其中高芽孢率的MB35-5还具有解磷、解钾、降解纤维素和促生功能,同时具备耐盐碱、耐低氧等抗逆性,表明该菌株具有进一步试验和研发的潜势。     

Ensifer alkalisoli YIC4027趋化受体基因的比较及相关蛋白序列分析

[目的] 田菁共生根瘤菌Ensifer alkalisoli YIC4027是从宿主植物田菁的根瘤中分离出来的一株新型高效的固氮菌。本研究对E.alkalisoli的趋化受体基因与其他研究透彻的物种进行比较以及相关蛋白分析。[方法] 利用NCBI的BLAST对E.alkalisoli趋化受体基因进行序列相似性搜索。以Pfam数据库为基础,用HMMR3对甲基化趋化受体蛋白（MCP）进行比较分析。[结果] E.alkalisoli有2个趋化基因簇,共有13个MCP,含有不同的信号传感结构。此外,这些MCPs的胞质结构域除了一个是由40个七肽重复序列组成,其余都是由36个七肽重复序列组成。[结论] 尽管E.alkalisoli的趋化受体与已被广泛研究的物种的趋化受体具有较高的相似性,但仍显示出其特性。通过基因的比对以及相关蛋白的分析,我们能够更好地理解E.alkalisoli是如何通过趋化系统来响应外界变化的。