猪流行性腹泻病毒经其附属蛋白抑制细胞凋亡

【背景】orf3位于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) s基因与e基因之间,是目前发现的PEDV唯一一个附属基因,编码附属蛋白(ORF3蛋白)。我们前期研究初步发现ORF3蛋白对PEDV诱导的细胞凋亡有影响。【目的】研究ORF3蛋白在PEDV侵染复制过程中的毒力作用机制。【方法】实验用3种PEDV:rDR13att-?ORF3 (orf3基因全部敲除)、DR13-ORF3att (携带有C端截短orf3)、rDR13att-ORF3wt(携带全长orf3基因)感染Vero细胞,观察病变情况,再用活细胞成像仪、流式细胞仪、 DNA断裂的原位末端标记法[terminaldeoxynucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL]等方法检测不同感染时间点的细胞凋亡情况,然后用蛋白质印迹方法分析PEDV感染宿主细胞中主要凋亡相关蛋白(如Caspase-3)的活化或裂解,最后进行转录组测序研究病毒感染细胞中差异基因的表达情况,再用荧光定量PCR验证转录组结果。【结果】rDR13att-?ORF3引起较多的细胞病变,活细胞成像仪的动态观察结果显示,3种病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其他两种病毒更高;敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒;病毒rDR13att-?ORF3感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR13-ORF3att和rDR13att-ORF3wt更多;表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化;ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 kD protein 1B (HSP70)基因转录有促进作用,荧光定量PCR结果表明rDR13att-ORF3wt感染细胞的HSP70表达量高于rDR13att-?ORF3感染细胞。【结论】PEDV通过ORF3蛋白抑制细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白胞内区线性B细胞表位最小基序鉴定

[背景] S蛋白是猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,在前期的研究中,本课题组在S蛋白的胞内区鉴定到2个包含线性B细胞表位的短肽。[目的] 鉴定PEDV S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[方法] 原核表达2个短肽的每次后移1个氨基酸的系列8肽,以兔抗S蛋白血清为一抗,通过Western Blot筛选阳性反应8肽,鉴定S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[结果] S蛋白胞内区的2个包含线性B细胞表位的短肽共享一个表位,该表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴。同源性分析显示该B细胞表位基序为保守性表位。[结论] 确定了S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴;S蛋白抗原表位的鉴定有助于提高对其结构和功能的理解。     

猪戊肝病毒存在准种现象

为研究猪戊肝病毒准种存在情况,采用逆转录-巢式聚合酶链反应法(RT-nested-PCR)对四株猪戊肝病毒(Hepatitis E virus)第2可读框(ORF2)部分序列进行PCR扩增,将产物克隆后,每个毒株分别随机挑取20个阳性克隆测序,进行DNA序列分析。结果显示4株HEV不同克隆间的ORF2核苷酸序列同源性分别为96.8%~99.7%、98.8%~99.7%、98.8%~99.7%和100%,有变异的克隆核苷酸序列与上海株(SAAS-JDY5)同源性为96.8%~100%。由此证实感染戊肝病毒的猪个体内存在HEV准种。     

ORF3蛋白促进猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上的增殖

【背景】猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪而引起的一种急性肠道传染病,常导致病猪水样腹泻、呕吐、脱水。自2010年起,其大规模的暴发给养猪业造成巨大的经济损失。由于对PEDV免疫机理及侵入机制知之甚少,至今仍缺乏有效的PED防治措施。【目的】研究orf3对PEDV体外增殖的影响。【方法】利用基于RNA同源重组的PEDV反向遗传学操作技术拯救一系列携带不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV;将获得的重组PEDV以MOI 0.1感染Vero细胞,分别于感染的第8、16、24、32、40、48 h测定其TCID_(50)并绘制病毒生长曲线;分别在感染25 h和36 h利用全自动细胞计数分析仪对6孔板内的细胞进行计数,并于感染后的第12、24、36、48 h用CCK-8试剂盒对其细胞活力进行测定。【结果】RT-PCR结果及细胞病变观察证明成功拯救到了携带不同orf3基因或orf3基因缺失的重组PEDV;进一步的免疫组化分析结果证实PEDV的ORF3蛋白可以在Vero细胞中合成。SPSS软件分析表明携带orf3基因的重组PEDV的滴度(TCID_(50))显著高于缺失orf3基因的重组PEDV的滴度;带有orf3基因的重组PEDV感染Vero细胞25 h和36 h时的活细胞数显著高于缺失orf3基因的重组病毒感染相同时间时的活细胞数;而且重组PEDV感染Vero细胞24 h后,带有orf3基因的重组PEDV的细胞活性显著高于缺失orf3基因的重组病毒。【结论】ORF3蛋白对于PEDV在Vero细胞中的增殖具有促进作用,该作用是通过延缓或减少感染细胞的死亡实现的。本研究为揭示PEDV orf3基因的功能和PEDV复制机制的研究提供理论基础。     

猪流行性腹泻病毒S2截短肽的原核表达及其线性B细胞表位区鉴定

【背景】由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV S蛋白可以诱导宿主产生中和抗体。【目的】原核表达PEDV CV777疫苗株S2截短肽(aa:961-1 382)并制备其多克隆抗体;鉴定表达的S2截短肽上的线性B细胞表位区。【方法】将经密码子优化的PEDV S2截短肽编码DNA (s2t)克隆至载体p ET-28a中并转化Escherichia coli BL21(DE3),利用IPTG诱导S2截短肽表达。以经SDS-PAGE切胶纯化的重组S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。在E. coli BL21中GST融合表达覆盖S2截短肽序列全长、彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S2截短肽兔血清为一抗,通过Westernblot(WB)筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S2截短肽上的线性B细胞表位区。【结果】重组PEDV S2截短肽的相对分子质量约为50 kD;诱导4 h表达量最高,且主要形成包涵体。WB结果显示,纯化的S2截短肽能被猪抗PEDV血清识别;以纯化的S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多抗血清,ELISA法检测抗体效价位于1:25 600-1:102 400之间。免疫组化和间接免疫荧光分析均表明,制备的多抗血清可以识别Vero细胞培养的PEDV DR13弱毒株。以制备的多抗血清通过WB从52个GST融合表达的16肽中鉴定到11个阳性反应性16肽。WB分析显示,得到的阳性反应性16肽都可以被猪抗PEDV血清识别。鉴定到的阳性16肽在S2截短肽上形成4个线性B细胞表位区(aa:969-984;1 065-1 096;1 225-1 280;1 361-1 382)。【结论】高效价抗PEDV S2截短肽多克隆抗体的制备和S2截短肽上线性B细胞抗原表位区的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立有效的PEDV检测方法奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒诱导的猪肠道-乳腺-sIgA轴以及免疫机制探讨

猪的“肠道-乳腺-sIgA轴”免疫通路是指侵染猪的胃肠道病原通过胃肠道免疫可以激发乳腺产生sIgA;sIgA被初生仔猪摄取可以获得针对胃肠道病原的被动免疫保护。该免疫通路的反应动力模式涉及病原侵染、抗原提呈、淋巴细胞活化、淋巴细胞的肠道和乳腺归巢以及抗体分泌等诸多环节,受到病原毒力、母猪的妊娠阶段及免疫生理状态等众多因素影响。目前,猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）诱发的“肠道-乳腺-sIgA轴”的理论可以解释自然感染状态下哺乳仔猪获得的被动免疫保护,但根据这一概念所设计的疫苗和免疫方案并未取得满意效果。本文综述了PEDV感染和宿主免疫各个环节的研究现状,分析了影响PEDV免疫和肠道-乳腺-sIgA轴系反应的关键病原和宿主因素,提出了在轴系理论基础上应重视PEDV灭活疫苗以及特异IgG作用的建议。     

猪流行性腹泻病毒免疫及疫苗研制

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是严重危害我国和世界养猪业的重要动物疫病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),属冠状病毒科α冠状病毒属。文中综述分为5个部分。前两部分在介绍该病病原及其流行病学的基础上先概括了初生仔猪的被动免疫途径和初乳的重要功效。第三部分总结了母猪孕期免疫的特点,讨论了"肠道-乳腺-sIgA轴"理论及其可能的作用机理,提出了一系列PEDV免疫防控中应重点关注的理论技术问题。最后两部分分别总结了PEDV疫苗的研发现状并对PEDV免疫防控的未来发展作了展望。     

猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白40–91 aa是其细胞质定位的关键结构域

ORF3蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)基因组编码的唯一的辅助蛋白,与病毒毒力相关。为确定PEDV ORF3细胞质定位信号,文中构建了系列PEDV DR13wt ORF3蛋白全长或截短肽重组表达载体,转染Vero细胞并利用激光共聚焦显微镜分析与EGFP融合表达的全长ORF3蛋白和其系列截短肽在细胞内的分布。结果表明,全长ORF3蛋白或所有包含2个跨膜域的40–91 aa基序的ORF3截短肽均只定位于细胞质中,而不包含40–91aa基序的ORF3截短肽分布于整个细胞中(细胞质和细胞核均有分布)。这表明40–91 aa是猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白细胞质定位的关键结构域。PEDVORF3蛋白细胞质定位结构域的明确为进一步研究其细胞内转运和生物学功能提供了参考。     

猪戊型肝炎病毒防控及研究策略分析

戊型肝炎为人畜共患病病原, 猪是主要的病毒储库。我国猪场戊肝病毒流行情况复杂, 猪感染率高, 同一地点存在3型或/和4型两种基因型混合污染。病毒存在基因重组和准种现象, 为病毒遗传进化提供了遗传基础。当前猪戊肝感染人的主要媒介为污染的猪肉及其制品, 其他感染机制和途径还有待进一步阐明。应加强对猪HEV与猪场其他流行病原体相互关系的研究, 同时应加强猪HEV相关信息的积累分析包括对猪HEV感染特性和遗传特性进行实时监测, 将猪HEV流行情况纳入兽医公共卫生预警体系, 实现常态跟踪。     

西藏株小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

【背景】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展。【目的】原核表达PPRVH蛋白,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因。将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E. coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达。以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体。【结果】重组E. coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7 h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli(pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6400-1:25600之间。【结论】原核表达了PPRVH蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础。