多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞

为建立多顺反子质粒载体转染技术获得人脂肪干细胞(adipose stem cells,ASCs)来源的诱导多能干细胞(induced pluripotency stem cells,iPSCs),应用2A元件连接Oct4/Sox2/KLF4/c-Myc四因子基因,构建为单一开放阅读框的多顺反子质粒载体．使用该质粒对ASCs进行转染及重编程为iPSC．采用形态学观察、特异性抗体免疫荧光鉴定、体外拟胚体诱导分化和体内畸胎瘤形成等方法进行鉴定．结果显示,ASCs成功重编程为iPSCs,具有与人胚胎干细胞相似的形态学及多向分化潜能;通过拟胚体和畸胎瘤实验证实iPSCs能在体内外分化成三胚层细胞;DNA印迹实验显示质粒载体序列未整合至iPSCs基因组中．因此,通过多顺反子质粒载体重编程技术成功建立的人iPSCs具有多向分化潜能,可减免发生插入突变和免疫排斥问题,为iPSCs在遗传性或退行性疾病的治疗奠定了实验基础．     

新型旋转壁式生物反应器内三维组织工程骨的构建

利用微载体悬浮培养法将成骨细胞在旋转壁式生物反应器内进行大规模扩增,并检测细胞的组织形态和生物功能.然后以此作为种子细胞,分别以2×10⁶个/ml和1×10⁶个/ml两种密度接种到支架材料上,于旋转壁式生物反应器(RWV)内进行三维组织工程骨的构建.并将所构建的骨组织分别进行倒置显微镜(inverted microscope)、扫描电镜(SEM)、碱性磷酸酶(ALP)、矿化结构和AO/EB双重荧光染色等生物学性能检测,以及对培养过程的营养物质代谢情况进行监控和分析.结果表明,在RWV中培养的骨组织生长良好,分泌大量胶原纤维,并有矿化基质和新骨样组织形成. 由上述结果可断定,通过RWV内部流体对流所产生的应力刺激,可提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性表达,并加速矿化结节的形成,从而完成成骨细胞的快速增殖与分化以及工程化组织的三维构建.     

1-磷酸鞘氨醇促进间充质干细胞向心肌分化

为研究1-磷酸鞘氨醇 (Sphingosine-1-phosphate,S1P) 对脐带间充质干细胞 (Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs) 和脂肪间充质干细胞 (Adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs) 向心肌分化的影响,探索其适宜的作用时间和浓度,将UC-MSCs和AD-MSCs接种到培养板,用添加不同浓度S1P的心肌细胞培养液诱导两种干细胞向心肌分化,诱导时间分为7 d、14 d和28 d。采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白,α-肌动蛋白 (α-actin)、缝隙连接蛋白 (Connexin-43) 以及肌球蛋白重链 (MYH-6) 的表达,并通过共聚焦显微镜和荧光显微镜进行观察;采用MTT分析细胞的活性;膜片钳检测分化细胞的钙瞬变 (此为心肌细胞的功能性指标)。结果表明,S1P与心肌细胞培养液协同作用,能够促进UC-MSCs和AD-MSCs向心肌细胞的分化。并且,随着S1P浓度的增加,促分化作用增强,但细胞活性降低。S1P在心肌细胞培养液中的适宜作用时间为14 d,适宜作用浓度为0.5 μmol/L。而且联合心肌细胞培养液可以使UC-MSCs和AD-MSCs的心肌分化细胞产生钙瞬变,具有类似心肌细胞的功能性。S1P能够与心肌细胞培养液协同作用,促进UC-MSCs和AD-MSCs的心肌功能性分化。