猪链球菌2型FBPS的纤连蛋白结合部位的初步确定

根据猪链球菌2型江苏分离株HA9801的fbps基因序列,设计合成不同的引物,用含全长fbps的pMD-T-FBPS质粒为模板,通过PCR技术,扩增不同片段fbps,并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET-32a( ),构建分别表达全长7~82、7~165和87~320氨基酸FBPS的重组表达质粒pFBPS、pFBPS(7~82)、pFBPS(7~165)和pFBPS(87~320);将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE)株,经IPTG诱导,表达rFBPS(7~82)、rFBPS(7~165)、rFBPS(87~320)和rFBPS(全长),分子量分别为29、34、42及83kD的融合蛋白。配基亲和Western blot试验表明,表达的融合蛋白除rFBPS(7~82)外,均可与人纤连蛋白(Fn)结合,由此可以推断SS2的纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(FBPS)N端87~165氨基酸区域为具有结合活性的线性部位。     

传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

以5株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)单克隆抗体HNF1、HNF7、B34、2B1和2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,用间接ELISA检测,A值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位.选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列.进一步将其与GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu-Ala-Ser-Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1、HNF7、B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位.     

传染性法氏囊病病毒多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析

用5株传染性法氏囊病病毒(IBDV)单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-5epis,在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS,经SDS-PAGE分析,r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析,结果表明,r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔,400μg/只/次,免疫2次,间隔7d,用IBDV间接ELISA检测血清抗体,第一次免疫7d后抗体效价为1∶4000,第二次免疫14d后抗体效价升高到1∶256000,说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡,50μg/只/次,免疫2次后,血清抗体效价可达到1∶12800,用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡,r5EPIS免疫组全部存活,而单用佐剂对照组的死亡率为86.7%(13/15),证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答,预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。     

猪源马链球菌兽疫亚种表达的类M蛋白黏附抑制性单抗的获得

根据马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)猪源株ATCC35246株的类M蛋白基因序列,通过PCR技术,扩增出无信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a( )中。重组质粒经酶切鉴定和测序后,在大肠杆菌BL21中表达,获得60kDa产物,Western blot显示,其与ATCC35246株多克隆抗血清反应,抗原性良好。以His亲和层析柱纯化重组类M蛋白作为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备了12株稳定分泌抗类M蛋白单抗的细胞株,特异性检测显示其与A群链球菌、猪链球菌2型以及马链球菌马亚种等没有交叉反应。单抗亚类鉴定显示,其中6株为IgG1,3株为IgG2,另外3株为IgM。从腹水中纯化的单抗效价为2.56×104~1.01×105。黏附抑制实验显示,其中一株单抗能阻断类M蛋白黏附HEp-2细胞。     

Ⅱ型猪链球菌二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体的构建

构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体。构建中间为壮观霉素抗性基因, 两侧为2148hk/rr编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒, 通过同源重组筛选2148hk/rr编码基因敲除突变体。PCR分析和Southern杂交结果均显示2148hk/rr编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代, 基因敲除突变体构建成功。筛选获得05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体, 为阐明该调控系统在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

以5株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)单克隆抗体HNF1、HNF7、B34、2B1和2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,用间接ELISA检测,A值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位。选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gIII部分基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列。进一步将其与GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu-Ala-Ser-Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1、HNF7、B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位。     

猪链球菌2型mrp基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验

根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）国外分离株的溶菌酶释放蛋白（Muramidasereleased protein, MRP）的基因序列,设计并合成一对引物,利用PCR技术扩增了江苏分离株的开放阅读框298～827bp间529bp的基因片段,并定向克隆至pET32a(+)表达载体中。重组质粒经限制性酶切鉴定和测序,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,可表达分子量约42kD的蛋白。经过镍亲和层析柱层析,获得纯化的重组蛋白。以重组蛋白免疫Balb/c小鼠,以5LD50猪链球菌强毒株攻击后小鼠的相对存活率达625%。证实所表达的MRP片段为重要的保护性抗原。     

马链球菌兽疫亚种类M蛋白的基因克隆、序列分析及其在猪源链球菌的检测

根据已发表的马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp .zooepidemicus)马源株的类M蛋白基因序列 ,设计和合成一对引物 ,以兽疫亚种猪源ATCC35 2 4 6株的基因组DNA为模板 ,通过PCR技术 ,扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET_32a( )中 ,测定其序列 ,GenBank接收号为AY2 6 3781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框 ,全长为 1137bp ,编码 379个氨基酸残基。经DNAStar软件分析 ,ATCC35 2 4 6株类M蛋白基因与兽疫亚种马源W6 0株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为 86 9%、30 8%、2 9 4 % ;推导的氨基酸序列的同源性分别为 84 3%、2 1 9%、2 3 4 %。但ATCC35 2 4 6株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验 ,检测 34株猪源链球菌类M蛋白基因 ,发现所有 16株C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因 ,而所有猪链球菌 (Streptococcussuis) 1型和 2型菌株及S群、B群、D群链球菌共 13株均不能检出类M蛋白基因 ,而 5株未鉴定的猪源链球菌中 3株能检测出类M基因。     

EHEC O157:H7 z3276基因缺失株构建及其生物学特性

【目的】肠出血性大肠杆菌O157:H7是世界范围内重要的动物源性致病菌之一,可感染人。I型菌毛是多种致病性大肠杆菌(如肾盂肾炎型大肠杆菌等)可表达的一种黏附结构,与细菌吸附黏膜表面密切相关。然而,O157:H7 fim操纵子上几个核苷酸的缺失却导致其不能表达I型菌毛。BLAST比对结果表明O157:H7独有的开放阅读框z3276编码的氨基酸序列与其他大肠杆菌I型菌毛高度同源,这可能是对O157:H7不能表达I型菌毛的补偿机制,但确切功能尚不清楚。本文探究z3276基因的生物学功能。【方法】利用O157:H7 86-24参考菌株构建z3276基因缺失株(?z3276),并构建其互补株(C?z3276),进而比较亲本株、?z3276与C?z3276的生物学特性及对小鼠致病性差异。【结果】与亲本株相比,?z3276进入对数生长期的时间延后,在半固体琼脂平板上的迁移直径明显缩小,生物被膜形成能力显著减弱。?z3276对HEp-2细胞的黏附和侵袭能力并无明显变化,但对IPEC-J2细胞的侵袭能力明显减弱。在小鼠攻毒试验中,?z3276组排菌数量减少、排菌持续时间缩短。C?z3276各项特性均能回复到与亲本株一致的水平。【结论】z3276基因可能是O157:H7重要的毒力相关因子。     

Ⅱ型猪链球菌二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体的构建

构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体.构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为2148hk/rr编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选2148hk/rr编码基因敲除突变体.PCR分析和Southern杂交结果均显示2148hk/rr编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代,基因敲除突变体构建成功.筛选获得05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体,为阐明该调控系统在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础.