替换HIV-1衣壳蛋白基因SHIV的构建及其活性测定

将猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus,SIVmm239)中gag基因的衣壳蛋白部分置换成人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV-1HXBc2)的相应部分,构建出替换了衣壳蛋白基因的人/猿嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)原病毒DNA。用此SHIV原病毒DNA转染293T细胞,细胞中能够检测到嵌合病毒基因的转录与翻译;在细胞培养液上清中亦可检测到装配出的病毒颗粒。病毒颗粒形态正常,含有基因组RNA,具有反转录酶活性,嵌合的外源衣壳蛋白能够正确剪切,形成棒状的核心。将此嵌合SHIV病毒感染MT4细胞,病毒能够吸附并进入细胞,能完成反转录过程,但不能增殖。     

JDV Tat反式激活LTR与HIV-1 Tat采用类似的细胞因子

为分析JDV Tat在反式激活JDV及HIV-1 LTR过程中是否采用与H1V-1 Tat类似的细胞因子,本文构建了包含完整激活域的jTat70和hTat47,同时构建了cyclin T1和CDK9真核表达及反义转译质粒。过量表达hTat47和jTat70对hTat反式激活HIV-1 LTR,jTat反式激活JDV和HIV-1 LTR均有明显的抑制作用推测jTat和hTat的反式激活作用可能涉及类似的细胞因子。通过cyclin T1和CDK9的反义转译质粒对jTat反式激活的抑制作用证实这两种细胞因子参与了jTat对JDV和HIV-1 LTR的反式激活。     

全基因组SHIV-KB9克隆的构建及其在人、猴外周血单核细胞中的复制

将分别携带SHIV-KB9 (SIV/HIV-1 KB9) 基因组的3′端和5′端的两个半长克隆,体外连接成SHIV-KB9全基因组克隆.含有全长基因的质粒培养时易发生同源重组和缺失,采用JM109作为宿主菌以及30℃、低转速的培养条件,可保持质粒的稳定性.通过PCR , RT-PCR 和猴免疫缺陷病毒(SIV) gag p27 核心抗原滴度检测表明感染性克隆SHIV-KB9可有效在人、恒河猴及食蟹猴的外周血单核细胞中复制.     

RU5区对BFV3026基因表达的调控

以牛泡沫病毒(Bovine foamy virus, BFV)中国株BFV3026原病毒DNA为材料,构建R区系列缺失质粒, 通过对其转染细胞中RT水平及对缺失质粒与luc报告质粒共转染细胞中萤火虫荧光素酶活性的测定,确立U5区对于BFV3026两类启动子LTR和IP均具有负调控作用;同时将带有不同R区的BFV3026结构基因片段克隆于异源启动子CMV之下,通过对其转染细胞293T中RT酶活性的测定,确立R区对于病毒结构基因pol的表达具有一定的调节作用,并将其功能区域初步界定在R区5′端100bp内.     

重组HIV表面抗原gp120的表达纯化及免疫学鉴定

为研制具有流行特点的HIV血清学诊断试剂,采用pET系统表达HIV-1表面糖蛋白gp120。研究发现,全长的gp120在E.coli中不能有效表达;N端半长的gp120可以表达,但表达量很低;仅保留N端1/3的gp120(包含gp120V1/V2抗原决定簇)有效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的18%;Westernblot显示较好的反应原性;通过金属螯合层析,产物得到完全纯化。在这些结果的基础上,我们表达了流行株的gp120片段,为探索gp120在大肠杆菌的高效表达,建立针对中国人群的HIV血清学诊断系统奠定基础。     

甘油对单链构象多态性分析的影响

单链构象多态性(single strand conformation poly-morphism,SSCP)分析是以PCR技术为基础检测DNA多态性的一种方法。其基本原理是:单链DNA在进行不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)时,迁移率除与DNA单链的长短有关外,更主要取决于DNA单链所形成的具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基顺序决定,其稳定性靠分子内部局部顺序的相互作用来维持。相同长度的单链因其顺序的不同,甚至单个碱基的不同,所形成的构象不同,导致迁移率的变化而出现泳动变位(mobili-ty shift)。该方法自建立起来不断地发展、完善,应用范围也日益广泛。特别是在人类癌基因和抑癌基因突变的检测、基因诊断、连锁分析、基因作图等领域成效突出。     

牛免疫缺陷病毒反式激活因子功能域的研究

牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus, BIV)与人免疫缺陷病毒(Human immunod eficiency virus, HIV)同属反转录病毒科慢病毒属[1].BIV基因组5′端的长末端重复序列(LTR)起始病毒结构基因和非结构基因的转录[2],因而许多细胞因子和病毒编码的调节蛋白作用于LTR,以调节BIV的基因表达.     

牛免疫缺陷病毒长末端重复序列(BIV一LTR)在大肠杆菌中的启动子功能

牛免疫缺陷病毒（ＢＩＶ）的长末端重复序列（ＬＴＲ）含有病毒的启动子,调控病毒在真核细胞中的表达。我们将ＢＩＶＬＴＲ与萤火虫荧光素酶基因连接构建成重组质粒ｐＢＩＶ一Ｌｕｃ,该质粒能在Ｅｃｏｌｉ中有效地表达出荧光素酶的活性,从而证明ＢＩＶＬＴＲ在大肠杆菌中也具有启动子功能。Ｍｕｎｇｂｅａｎ核酸酶作图分析发现,ＢＩＶＬＴＲ在Ｅｃｏｌｉ中的转录起始位点位于Ｕ_３区,而不是在真核细胞中的Ｕ＿３一Ｒ交界处。同时我们也证实了ＢＩＶＬＴＲ在Ｅ,ｃｏｌｉ中仍可被ＢＩＶｔａｔ蛋白特异性地反式激活,为研究ｔａｔ蛋白的作用机制提供了一条新的途径。