枯草芽孢杆菌渗透压调节基因proB的克隆和表达

用PCR扩增的方法从耐盐的枯草杆菌中克隆出一个13kb长的DNA片段,经功能检测,证明正向插入片段与大肠杆菌的脯氨酸营养缺陷特性(proB-)能够营养互补。含有该重组质粒的大肠杆菌DH5α在基本培养基上的耐盐能力从2%提高至4%。通过引物步行法测定了该插入片段的核苷酸序列。利用DNAsis软件进行序列分析发现,该片段第122～1235bp核苷酸编码一个由370个氨基酸组成的蛋白质分子,其上游存在非典型的-10区,典型的-35区和核糖体结合位点,起始密码子处有最佳翻译起始效率的侧翼核苷酸序列。将其与Genebank中的已知基因的序列和编码的氨基酸序列进行同源性比较,结果表明该片段与枯草杆菌168的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分别为81%和90%。证明该基因确实是一个proB基因。通过与三十个不同种属微芽生物proB基因的氨基酸序列比较,发现该蛋白存在有可能与形成酶的活性中心和三维结构有密切关系的几个绝对保守的区域。     

构建定向T载体用于基因克隆和表达

传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM;设计一对引物在5端各引入一个BfuⅠ位点,下游引物紧邻BfuⅠ位点引入13 bp的部分LacO序列,用该引物从pHBM2002上扩增Prrn-gfp表达盒,插入PET-23aM的NdeⅠ和XhoⅠ位点,得到定向T载体pETG。PCR扩增的目的基因通过下游引物引入7 bp剩余的LacO序列,该基因片段与BfuⅠ酶切制备的定向T载体连接、转化大肠杆菌DH10β感受态细胞,通过补加了X-gal的平板筛选蓝色重组子。质粒酶切和PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100%,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cDNA,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子。随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达。该结果表明定向T载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达。     

耐热羧肽酶Taq基因在毕赤酵母中的表达

为了获取表达羧肽酶Taq毕赤酵母工程菌,通过密码子优化,依据毕赤酵母密码子偏爱性,在体外合成了栖热水生菌的耐热羧肽酶Taq基因。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体p HBM905A上并引入6×His标签,构建了重组质粒p HBM905A-Cpase Taq。将该重组质粒转化毕赤酵母GS115,经1%甲醇诱导表达72 h,酶产量达0.1 mg/m L。对纯化的重组酶进行酶活性分析表明在75℃,p H为7.5时,该酶比酶活性为80 U/mg。本研究首次证明了羧肽酶Taq能在毕赤酵母中有效分泌表达,可以被大量制备,进而为多肽水解为氨基酸奠定工业基础。     

利用3对引物鉴定产毒和非产毒微囊藻

根据微囊藻毒素合成酶基因簇序列 ,合成了 3对引物epF/mb1R ,mcF/teR ,mcF/umR ,通过全细胞PCR的方法检测了 19种不同来源微囊藻产毒的情况。 3种引物对 15株产毒微囊藻中均可扩增到预期大小的片段 ,测序结果证明这些片段是微囊藻毒素合成酶基因片段。PCR反应结果与HPLC分析所得到的结果有良好的对应性。在此基础上 ,初步确定了 3对引物检测产毒微囊藻对细胞浓度要求的下限。与其它引物相比 ,3对引物的特异性强 ,扩增条带大小适中 ,便于观察