乙肝病毒核心蛋白钉突部位基因工程改造对其功能的影响

通过在乙肝病毒核心蛋白钉突部位插入标签蛋白EGFP及小片段多肽,研究各种改造对HBc功能的影响。采用RLIC方法,构建野生型HBc、HBc钉突部位带不同接头的EGFP融合重组体、缩短的EGFP融合重组体,并构建与HBc功能互补的质粒HBV1.1c－,将不同重组体与HBV1.1c－共转染HEK293细胞,通过观察荧光及Southern blotting检测病毒复制中间体,判断相应基因工程改造对重组蛋白中不同结构域功能的影响。RLIC方法可有效地用来进行片段缺失,且缺失片段大小及位置无明显限制。带柔性或刚性接头的重组HBc-EGFP均可产生绿色荧光,但荧光在细胞内分布形态不同,两种重组HBc-EGFP均不能支持正常的HBV复制,各种截短的插入片段以及aa79-80单独缺失体亦不能支持HBV复制。结果表明RLIC方法是一种基因工程改造的有力工具,不同类型接头对重组蛋白的结构和功能有不同影响,aa79-80对维持HBc的主要功能之一——支持HBV复制有重要作用。     

一种适用于片段替换/插入突变扫描的克隆方法

功能序列的改造是基因工程的一项基础技术。序列改造往往涉及较大片段的插入或替换,为了获得更优化的改造序列,这种片段插入或替换经常需要以扫描方式进行。传统的酶切连接方式在这种情况下可能难以实现或者费时费力。建立了一种golden gate方法结合混合克隆和快速鉴定的策略（简称Gmix）,利用该策略,成功地将外源基因（Gaussia荧光素酶基因）以4种模式,扫描式插入或替换HBV复制质粒的指定区域。该方法成功率高,操作简便快速且成本较低,适合于其他DNA序列的类似改造工作。