河西绒山羊GOLA-DRB1基因第2外显子变异特征分析

采用PCR-SSCP、克隆测序等方法,分析600只河西绒山羊GOLA-DRB1基因第2外显子遗传特征、SNPs变异类型,同时分析该基因与山羊流产的关联性.结果表明,河西绒山羊DRB1基因第2外显子上存在26个等位基因,序列比对后发现26个等位基因中存在71个核苷酸变异住点,占分析位点总数的30％.其中转换位点25个,占核苷酸多态位点的35.21％;颠换位点35个,占核苷酸多态位点的49.3％;转换和颠换共存位点9个,占12.68％.山羊流产关联性分析结果表明,在河西绒山羊病例组中DRB1*18、DRB1*23、DRBl*26等位基因频率高于正常对照组(P＜0.05),x2值分别为6.31,4.859,6.396,RR值为2.55, 2.72,DRB1*8等位基因频率显著高于正常对照组(P＜0.01),x2值为17.618,RR值为3.59;病例组中DRB1*14等住基因频率低于正常对照组(P＜0.05),x2值为4.812,RR值为0.65,DRB1*1和DRB1*11显著低于正常对照组(P＜0.0l),其中B1的x2值和RR值分别为14.11和0.61,初步推断DRB1*8可能是河西绒山羊流产发病单体型中的遗传易感基因,DRB1*1和DRB1*11可能为其遗传保护基因.     

FTA卡和普通定性滤纸提取DNA方法研究

用FTA采样卡和普通定性滤纸采集藏绵羊血样,采用NaOH法提取血液基因组DNA,利用设计的一对引物对DRB1基因第三外显子进行扩增,通过PCR产物琼脂糖凝胶检测,对普通定性滤纸与FTA采样卡的两种提取DNA的方法进行比较,结果认为采用普通定性滤纸-NaOH法提取血液基因组DNA,NaOH的最佳洗涤浓度是25 mmol/L,采用FTA-NaOH法提取血液基因组DNA,NaOH的最佳洗涤浓度是20 mmol/L,但普通定性滤纸法提取血液基因组DNA平均成本远低于FTA采样卡,普通定性滤纸法提取血液基因组DNA具有快速、便捷、经济及高效的特点.     

硬脂酰-辅酶A脱氢酶基因在食品级乳酸菌中的表达

为了实现硬脂酰-辅酶A脱氢酶1编码基因在乳酸乳球菌中的表达,采用PCR技术扩增获得人类scd1的编码序列。Nco I和Xba I双酶切后定向插入到食品级表达载体pNZ8149中,构建表达载体pNZ8149-scd1。电转化乳酸乳球菌NZ3900,经菌落PCR和测序鉴定scd1基因成功插入到乳酸乳球菌中。在乳链菌肽诱导下进行scd1的表达,转化株提取脂肪酸,进行脂肪酸含量的气相色谱分析。结果显示,SCD1转化菌株中的C16∶1n-7和C18∶1n-7脂肪酸组分比转化pNZ8149的对照组乳酸菌分别提高了92%~169%和53%~127%。文中以scd1基因为例,尝试并证明了脂肪酸脱氢酶类基因能够在食品级乳酸菌中有效表达,为后续研究奠定了基础。     

甘肃河西地区西门塔尔杂交类群NGB基因第3外显子的遗传变异研究

旨在对甘肃河西的临泽、甘州、武威、金昌、高台5个地区283头西门塔尔杂交类群NGB基因第3外显子的遗传多态性及变异特征进行系统分析,采用PCR-SSCP方法检测了283头西门塔尔杂交类群NGB基因第3外显子和部分内含子的多态性,且对群体内各等位基因进行了测序。结果显示,5个地区西门塔尔杂交类群共检测出5个等位基因(A、B、C、D、E),表现为5种基因型(AA、AB、AC、AD、AE)。其中甘州、武威、金昌西门塔尔杂交类群NGB基因均只检测到AA、AB 2种基因型,高台西门塔尔杂交类群检测到AA、AE 2种基因型,临泽西门塔尔杂交类群检测到AA、AB、AC、AD 4种基因型。A等位基因和AA基因型的频率在5个群体中最高,为优势基因和优势基因型。对不同SSCP带型的对应片段进行测序分析,共发现6个核苷酸突变位点(75 bp C→T,78 bp C→G,128 bp G→A,214 bp G→A,232 bp C→T,233 bp G→A),其中第75 bp和第78 bp处的突变位点位于内含子区域,其余4处突变位点均位于外显子区域。第214 bp处的核苷酸突变导致甘氨酸(Gly)突变为丝氨酸(Ser),第232 bp处核苷酸突变导致精氨酸(Arg)突变为色氨酸(Trp),第233 bp处核苷酸突变导致精氨酸(Arg)突变为谷氨酰胺(Gln),经χ2检验结果显示,5个地区的西门塔尔杂交类群在此3个突变位点上都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05)。群体遗传学分析结果表明,临泽、甘州、武威、金昌、高台西门塔尔杂交类群的多态信息含量(PIC)分别为0.0582、0.0196、0.0196、0.0161、0.0159,均属于低度多态(PIC0.25)。     

绵羊EGFR基因的克隆、表达及序列分析

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是酪氨酸激酶受体家族成员之一,不仅参与细胞增殖、生长和凋亡等多种生命活动,也可调节哺乳动物的乳腺发育及泌乳维持,但对绵羊EGFR基因的序列特征及组织表达情况鲜有报道.本试验以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)及低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)母羊为研究对象,利用RT-PCR、克隆及测序技术获得绵羊EGFR基因完整的CDS区,分析了 EGFR蛋白的结构特征及理化性质,利用RT-qPCR技术研究了基因的组织表达情况.结果表明,绵羊EGFR基因CDS区全长为3 627 bp,编码1 208个氨基酸.绵羊EGFR的氨基酸序列在各物种间较保守,与黄牛EGFR的氨基酸序列同源性最高.EGFR为跨膜蛋白,包含111个磷酸化位点,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.网络互作分析表明EGFR蛋白与肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、表皮调节素(EREG)、双调蛋白(AREG)及生长因子受体结合蛋白2(GRB2)结合发挥作用.EGFR主要参与MAPK,PI3K/AKT,JAK/STAT及Wnt信号通路,从而参与了动物的乳腺发育及泌乳功能的调节.RT-qPCR结果表明,绵羊EGFR基因的表达具有组织特异性、时空特异性和品种特异性.该基因在所研究的8个组织中均表达,但在肾脏、卵巢、肝脏、乳腺和肺脏组织中的表达量较高;在小尾寒羊的乳腺组织中,该基因在空怀期的表达量显著高于泌乳高峰期的(P＜0.05);在泌乳高峰期的乳腺组织中,该基因在小尾寒羊中的表达量高于甘肃高山细毛羊的.本试验为深入研究绵羊EGFR基因的泌乳生物学功能提供了基础数据.     

用mtDNA D-环序列探讨蒙古和中国绵羊的起源及遗传多样性

为了在分子水平上探讨绵羊的起源,对中国和蒙古共20个绵羊群体、314只绵羊mtDNA D-环的部分序列进行了测定,结果表明：中国绵羊和蒙古绵羊mtDNA D-环区的部分序列中A、T、G、C含量没有明显的差别;蒙古绵羊的多态位点数（28．85％）略高于中国绵羊（24．22％）;中国绵羊群体的单倍型多样度在青海藏羊、甘肃藏羊、甘肃高山细毛羊、青海细：色羊、甘南藏羊、小尾寒羊和滩羊群体中较高,但在湖羊和岷县黑裘皮羊中较低;蒙古绵羊的单倍型多样度在Bayad和Baidrag群体中最高,但在Gobi—Altai群体中最低。从总体上看,蒙古绵羊的遗传多样性要略高于中国绵羊,例如单倍犁比例的平均值为86．06％（142／185）：78．83％（108／137）,单倍型多样度（Hd）的甲均值为0．976：0．936,核苷酸多样度（Pi（π））的平均值为0．036：0．034,平均核苷酸差异数（k）的平均值为23．50：22．48～217个中国和蒙古绵羊的单倍型序列的系统发生分析表明,中国和蒙古绵羊均有3个母系起源,被定义为A、B和C3类主要的单倍型。其中A类单倍型在所有中国绵羊群体及绝大多数蒙古绵羊群体（9／11）中占优势,平均比例为58．73％;B类单倍型居中,为24．88％;C类单倍型最少,仅为16．59％。进一步从GenBank获得的91个绵羊D-环区的序列与中国和蒙古绵羊D-环区的单倍型的进行网络关系分析,发现欧洲摩弗仑羊（European mouflon,O．musimon）与中国和蒙古绵羊具有较近的亲缘关系,但没有发现塬羊（Argali．O．ammon）、盘羊（0．rignei bochariensis）和东方盘羊（0．ammon nigrimontana）对中国和蒙古绵羊起源有贡献的证据。     

藏绵羊JNK1基因遗传特征及其适应性进化分析

JNKs(c-Jun N-terminal kinases)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的成员,主要参与动物应急反应和组织发育等生命活动的调控过程。为分析藏绵羊在高寒低氧环境中的适应性进化机制,利用PCR-SSCP技术对藏绵羊、甘肃高山细毛羊和滩羊的JNK1基因第1、第8外显子的分子遗传特征进行分析,从而明确3个绵羊群体JNK1基因遗传序列特征、单核苷酸突变位点、单倍型组成和群体遗传特性。结果表明,在3个绵羊群体JNK1基因第1外显子区均检测到AA、BB和AB 3个基因型和1个突变位点,其中AA基因型和A等位基因为藏绵羊的优势基因型和优势等位基因,显著高于甘肃高山细毛羊和滩羊。在第8外显子区检测到EE、FF和EF 3个基因型,发现3个碱基插入和1个SNPs,其中等位基因F为藏绵羊和甘肃高山细毛羊的优势等位基因。研究结果与3个绵羊群体所处海拔高度及所受外界环境应激反应(高寒低氧)的强弱是相一致的,表明JNK1基因可以作为藏绵羊的高原适应性进化研究以及抗逆/病性分子选育的候选基因。研究结果将为藏绵羊的遗传改良和种质创新提供基础数据。     

牦牛KAP6-1和KAP6-4基因序列变异分析

角蛋白关联蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)是毛纤维的主要结构成分。以甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛和野血牦牛为研究对象,应用PCR-SSCP方法检测KAP6-1和KAP6-4基因外显子序列多态性。结果表明4个牦牛群体的KAP6-1基因外显子区存在c.42TC、c.135CT的同义突变及c.173GC、c.175GT的非同义突变,导致p.Cys58Ser和p.Gly59Cys的氨基酸残基改变;另外检测到1处45 bp的插入/缺失突变导致16个氨基酸残基的插入/缺失;甘南牦牛PIC值0.222 3为低度多态,其他3个牦牛群体PIC值0.393 4~0.4672为中度多态。牦牛KAP6-4基因外显子区检测到c.51CT、c.54CA、c.78TC、c.96TC和c.135TC的同义突变,以及c.118AG的非同义突变,导致编码的氨基酸残基p.Ser40Gly的改变;4类群牦牛PIC值为0.2658~0.387 2为中度多态。聚类分析表明牦牛KAP6-1基因外显子区碱基序列与普通牛、绵羊和山羊的同源性最高,其亲缘关系和系统进化远近一致。     

山羊KRTAP26-1基因鉴定及其遗传特征研究

角蛋白关联蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)是羊毛和羊绒的主要结构成分,决定了它们的理化性质。在人类、家犬、小鼠和大鼠中已描述了高硫蛋白KAP26-1的编码基因,但在山羊中该基因尚未被鉴定。本研究以人类KRTAP26-1基因编码区序列为模板,利用BLAST软件,在山羊基因组中发现了与人类KRTAP26-1基因具有高度同源性的序列并被假定为山羊的KRTAP26-1基因。PCR-SSCP分析发现,在5个山羊群体的605个个体中有4条不同的核苷酸变异序列(定义为A~D)。序列同源性和进化树研究结果表明,这4条序列与已鉴定的其它山羊KRTAPs基因序列有较低的同源性,但与人类、家犬、小鼠和大鼠的KR-TAP26-1基因序列具有最高的同源性。这说明发现的这4条序列是山羊KRTAP26-1基因的等位基因。4个等位基因的编码区内,共发现了6个SNPs位点,其中3个是非同义突变,造成了氨基酸序列的变化。4条多肽链含有36~38个磷酸化位点。5个山羊群体均处于中度多态,但是等位基因频率分布在不同群体间有差异。等位基因A、B和D在5个山羊群体中均出现,但C在中卫山羊中没有出现。结果表明,山羊KR-TAP26-1基因有较为丰富的核苷酸序列变异,这些变异可能与绒山羊的产绒性能有关。     

利用不同方法从深加工牦牛肉产品中提取基因组DNA效果的比较

为了从深加工牦牛肉产品中获得片段较大、数量较多的基因组DNA,以用于分子追溯的检测,尝试并系统地比较了异硫氰酸胍法、酚-氯仿抽提法和试剂盒提取法的提取效果。通过定量分析、凝胶电泳和PCR片段大小梯度扩增等手段,对利用3种方法提取的基因组DNA的数量和质量进行了比较。结果显示,利用酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA质量不佳,异硫氰酸胍法和试剂盒提取法的提取效果相当,PCR可以扩增出730 bp左右的核外基因细胞色素b,而核内基因只能扩增出300bp左右的核基因DNA片段(内乳铁蛋白基因,271 bp;BoLA-DRB3基因,302 bp)。综合考虑提取时间、费用、数量和质量等各方面的因素,认为异硫氰酸胍法操作简便、快速、廉价、有效,是较好的从动物深加工肉产品中提取基因组DNA的方法。