定量蛋白质组学分析PknG在分枝杆菌中的功能

丝氨酸苏氨酸蛋白激酶G(PknG)是分枝杆菌中一个类似于真核生物蛋白激酶C的蛋白质,对结核分枝杆菌的生长和新陈代谢等生理过程,以及结核分枝杆菌的耐药和在宿主细胞中的存活都起着重要的调节作用.本文在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)mc2155中构建了过表达结核分枝杆菌PknG的重组菌株PknG-mc2155,并发现PknG-mc2155的生长速度慢于mc2155.应用化学修饰结合LC-LC-MS/MS的定量蛋白质组学方法,在mc2155和PknG-mc2155中鉴定到了176种有差异表达的蛋白,其中152种蛋白在PknG-mc2155中表达下调,24种蛋白表达上调.这些差异表达的蛋白参与了多个细胞过程,包括代谢、蛋白翻译等.基于这些结果,我们推测PknG-mc2155生长速度慢的原因是因为代谢相关酶如GlpK,ALD和DesA1等蛋白表达的下调;而Ag85A,Ag85C,SecA2等蛋白的上调则增强细菌的感染性;另外KatG蛋白的下调提示PknG的过表达增强了菌株的抗药性.代谢组学分析发现谷氨酸和谷氨酰胺在PknG-mc2155中的水平低于在mc2155中水平,证实了PknG影响谷氨酰胺的稳态平衡.利用蛋白质磷酸化分析,我们发现PknG的苏氨酸残基T-320上有一个自磷酸化修饰,而且在PknG-mc2155菌株中,也鉴定到gltA和glmM上的磷酸化修饰,显示gltA和glmM是PknG的底物.本研究为理解PknG的功能和作用机制提供了新的依据和解释,为深入研究PknG在结核分枝杆菌中的功能奠定了基础,我们的结果也表明蛋白质组学技术是系统研究细菌蛋白质功能的重要工具.     

定量蛋白质组分析蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312介导的分枝杆菌耐红霉素机制

[目的]细菌耐药机制是个复杂的机制,系统生物学是系统性揭示耐药机制的有力研究手段。我们课题组前期研究结果显示,蚯蚓血红蛋白样蛋白msmeg_3312基因敲除后能够增加耻垢分枝杆菌对红霉素的耐药性,本文系统研究MSMEG_3312参与红霉素耐药性形成的机制。[方法]首先纯化MSMEG_3312蛋白,利用光谱及圆二色谱描述MSMEG-3312蛋白。利用定量蛋白质组学的方法比较分析敲除菌株Δmsmeg_3312与野生型菌株mc² 155蛋白表达的差异,并通过qRT-PCR进行验证。利用红霉素ELASA试剂盒测定Δmsmeg_3312与mc² 155的胞内药物浓度。[结果]光谱及圆二色谱分析确定MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白。定量蛋白质组学分析发现,红霉素未处理的条件下,相比于野生型菌株mc² 155,敲除菌株Δmsmeg_3312有包括3种转运蛋白在内的8种蛋白表达水平上调,14种蛋白表达下调;而红霉素处理后,Δmsmeg_3312中有448种蛋白差异表达,其中有11种转运蛋白表达上调,26种蛋白与氨基酸合成通路相关。胞内药物浓度检测显示敲除菌株Δmsmeg_3312的胞内红霉素浓度显著低于野生型菌株。[结论]蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312调控改变了细菌对红霉素药物处理的反应网络,其介导的红霉素耐药是一种集合抗生素耐受机制。     

结核病疫苗和耻垢分枝杆菌引起树突状细胞差异免疫反应的蛋白质组学分析

研究结核分枝杆菌和免疫细胞的相互作用对发展新的结核病防治策略至关重要.由于结核分枝杆菌生长缓慢,且需要在高等级生物安全实验室中进行操作,快速生长非致病的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)经常用来作为结核分枝杆菌的模式菌开展相关研究.为了探讨耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌对免疫系统产生的不同影响,本课题组利用缓慢生长的结核菌的减毒活疫苗卡介苗(BCG)和耻垢分枝杆菌mc2155分别感染小鼠(Mus musculus)树突状细胞DC2.4细胞,通过蛋白质组学分析,阐述宿主细胞对BCG和耻垢分枝杆菌不同的免疫反应.结果表明,BCG在DC2.4中生存时间比耻垢分枝杆菌长.定量蛋白质组学发现耻垢分枝杆菌激活了Ⅰ型干扰素信号通路,上调了AIM2,IFI204,IFIT1和ISG15蛋白的表达.相反,BCG的侵染对宿主细胞的蛋白组影响不大.分泌组学的结果显示,耻垢分枝杆菌的侵染诱导树突状细胞分泌更多的细胞趋化因子以及ISG15,TNF和IL-6等细胞因子,说明耻垢分枝杆菌的侵染促进了宿主细胞的细胞因子和趋化因子的释放,从而迅速地清除侵染的细菌.与此一致的是,耻垢分枝杆菌侵染的小鼠原代免疫细胞比BCG侵染产生更多的IFN-γ.进一步的研究发现,ISG15过表达阻止分枝杆菌进入宿主细胞.综上所述,本研究证明与缓慢生长的BCG相比,耻垢分枝杆菌引起宿主细胞更强烈的免疫反应,致使耻垢分枝杆菌在宿主细胞中被迅速清除.同时,本研究组发现耻垢分枝杆菌侵染引起的ISG15上调阻止了分枝杆菌进入宿主细胞.     

耻垢分枝杆菌的蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312影响其大环内酯类药物的敏感性

【目的】活性氧类分子是机体有氧代谢的自然产物,可以引起氧化损伤,导致细胞DNA突变、蛋白质失活,是细菌耐药产生的原因之一。蚯蚓血红蛋白家族是能携带氧、可逆地结合氧的一类蛋白,在氧代谢过程中发挥重要作用,与活性氧类分子介导的细菌耐药相关。预测耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白,其功能可能与细菌抗药性有关。【方法】通过生物信息学预测耻垢分枝杆菌MSMEG_3312的结构特征。通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析以及启动子表达测定等方法研究MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌抗药的相关性。【结果】与野生菌株mc2155相比,msmeg_3312敲除菌株表现为抗大环内酯类抗生素,而且回补msmeg_3312部分丧失了这种耐药表型。此外,大环内酯类抗生素的胁迫在统计上显著下调msmeg_3312启动子的表达。另外,对作用于核糖体的其他药物,敲除菌株和野生菌株没有抗药性差异。【结论】生物信息学分析显示MSMEG_3312的氨基酸序列具有典型的蚯蚓血红蛋白保守的HHE结构域,预测其二级结构含有4个α-螺旋组成的典型蚯蚓血红蛋白结构。MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌对大环内酯类抗生素的药物敏感性相关,其可能通过影响药物与核糖体50S亚基的作用来发挥功能。     

结核分枝杆菌耐氟喹诺酮类药物的分子机制研究进展

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)通过空气传播引起人类感染的慢性传染病,耐药结核分枝杆菌的流行是目前结核病防治的世界难题。氟喹诺酮类药物是人工合成药物,应用于耐药结核的临床治疗中,在治疗中起着核心的作用。但近年来,氟喹诺酮类药物的抗性菌株不断出现,愈发增加了结核病治疗的困难与治疗失败风险。在临床中氟喹诺酮药物的靶点比较清楚,是结核分枝杆菌的DNA旋转酶。目前发现结核分枝杆菌耐氟喹诺酮类药物的机制主要包括药物靶点DNA旋转酶的关键氨基酸改变、药物外排泵系统、细菌细胞壁厚度的增加以及喹诺酮抗性蛋白MfpA介导的DNA旋转酶活性调控。其中在氟喹诺酮靶标DNA旋转酶功能活性改变的耐药机制方面,编码DNA旋转酶基因突变一直是研究的热点,但近年来发现DNA旋转酶的调控蛋白MfpA以及DNA旋转酶的修饰在细菌耐药性中起着重要的作用,相关机制还亟待发现。本文综述了当前结核分枝杆菌耐氟喹诺酮类药物的作用机制,旨在为研发精准诊断技术和药物发掘提供科学理论基础和参考。     

分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknK的功能研究

【目的】丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶K(Serine/Threonine protein kinases K)是分枝杆菌类似真核样的蛋白激酶,预测在分枝杆菌的生长和新陈代谢等生理过程中起着重要的作用,解析PknK的生物功能及作用机制,将为结核病的防治提供一定的理论基础。【方法】通过基因敲除等遗传方法获得结核分枝杆菌疫苗株BCG的pknK敲除菌株△pknK、回补菌株pMV361-pknK/△pknK和过表达菌株pMV261-pknK/BCG;对获得的菌株进行生长曲线测定和抗药性分析;通过pulldown-MS方法及生物信息学方法鉴定了PknK相互作用蛋白。【结果】监测各种分枝杆菌△pknK、pMV361-pknK/△pknK和pMV261-pknK/BCG生长,确定PknK负调控BCG生长;抗药性分析显示PknK降低BCG的耐药性;pulldown-MS方法显示PknK与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknA和双组分系统中的反应调节因子MtrA、TrcR、MoxR等蛋白相互作用。【结论】研究发现PknK调控分枝杆菌的生长和耐药性,我们的研究为深入研究PknK在结核分枝杆菌中的功能奠定了基础。     

选择性σ因子SigF影响耻垢分枝杆菌的抗氧化能力

[目的]σ因子是细菌RNA聚合酶全酶的重要组分,包括必须σ因子和选择性σ因子.SigF作为重要的选择性σ因子影响结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的致病性和毒力等重要的功能.与之对应的在非致病性、快速生长的分枝杆菌耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)中,sigF的调控可能与其适应一定的生理环境相关.[方法]通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析,系统的研究了耻垢分枝杆菌SigF的应答调控.[结果]sigF敲除菌株与野生菌相比,对过氧化氢特别敏感,并且这种敏感性能够通过反式互补野生型的基因得到回复 ;由于细菌体内的抗氧化能力与耐药性有较高的相关性,进一步分析sigF敲除菌株的抗药性和抗氧化相关基因的表达情况,显示SigF影响细菌清除过氧化氢的能力,但是并不影响包括异烟肼等药物的敏感性及与异烟肼敏感性相关基因的表达.[结论]SigF调控的活性氧胁迫应答途径与异烟肼活化的氧化胁迫应答途径不同.另外,实验显示SigF参与了耻垢分枝杆菌的色素的合成,提示SigF参与的是光氧化胁迫应答途径,与药物引起的氧化胁迫应答途径是不同的通路.     

CTB/CS3融合蛋白与GM1结合能力和免疫原性的分析

免疫霍乱毒素B亚单位（CTB）或肠毒素大肠杆菌（ETEC）定居因子CS3可使人体对ETEC的侵染有保护作用.为探索研制ETEC双组分亚单位疫苗的可行性,利用大肠杆菌诱导表达系统表达了CTB与CS3的融合蛋白（CTB/CS3）.蛋白质印迹结果表明,诱导表达的29 ku蛋白具有CTB和CS3蛋白双重抗原性.经Ni-NTA亲和层析纯化获得重组蛋白CTB/CS3,复性的重组蛋白可以部分形成五聚体并保留了与神经节苷脂GM1的结合能力.动物实验表明,融合蛋白CTB/CS3具有CTB和CS3蛋白的双重免疫原性,同时,CTB的免疫载体作用提高了CS3的免疫强度.     

定量蛋白质组学分析ClpS在分枝杆菌耐药中的功能

ClpS是原核生物蛋白质降解复合物ClpAPS的重要组成成分,它可以识别某些特定的氨基酸序列并将其呈递给ClpAP以促进其降解。同时,ClpS也抑制了其他蛋白质底物的降解。本研究通过在耻垢分枝杆菌中过度表达ClpS,发现所构建的重组菌株提高了利福平的抗药性。应用定量蛋白质组学技术,我们系统地分析了过度表达ClpS对于细菌蛋白质组的影响,并推测出细菌抗利福平的分子机制:ClpS促进稳态的调整、促进药物沉降以及加速药物代谢。本研究首次通过改变细菌降解复合物的相关蛋白的表达增加细菌的抗药性,并证明蛋白质组学技术是细菌的抗药性研究以及耐药株筛选的重要工具。