基于CdSe阳离子交换的玉米赤霉烯酮新型荧光免疫检测方法的建立及应用

作为镰刀属真菌的次级代谢产物,玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)具有强烈的生殖毒性和免疫毒性,严重威胁动物和人类健康。本研究通过采用羧基修饰的CdSe水溶性量子点(quantum dots,QDs)标记ZEN单克隆抗体,并基于CdSe阳离子交换信号增强原理,建立了ZEN新型荧光免疫检测方法(CdSe QDs-FLISA),检测下限(IC₁₀)和半数抑制率(IC₅₀)分别为0.006 ng/mL和0.17 ng/mL,检测区间(IC₂₀-IC₈₀)为0.01-0.45 ng/mL。与ZEN的结构类似物(α-zearalanol、zearalanone、α-zearalenol、β-zearalenol and β-zearalanol)交叉反应性依次为22.3%、13.1%、6.2%、1.6%和3.9%,与农产品中其他真菌毒素如黄曲霉毒素B₁ (AFB₁)、赭曲霉毒素A (OTA)、呕吐毒素(DON)和伏马毒素B₁ (FB₁)几乎不存在交叉反应。该方法在玉米样本中加标回收率较高,且实际样本中ZEN的定量检测结果与LC-MS/MS一致性较好。本研究建立的CdSe QDs-FLISA操作简单,可实现对样本中ZEN的快速定量检测与分析,便于基层单位推广使用,具有较好的应用前景,同时也可为其他病原微生物检测技术的开发提供参考。     

单增李斯特菌末端氧化酶亚基QoxB的生物学功能探究

【目的】本研究旨在构建单增李斯特菌末端细胞色素aa3氧化酶亚基qoxB基因缺失株,并探索其在细菌生长及感染过程中发挥的生物学功能。【方法】利用同源重组方法构建获得缺失株ΔqoxB后,对野生株EGD-e和缺失株ΔqoxB的生长能力、细菌运动能力和细胞内黏附、侵袭、增殖及胞内迁移能力进行比较,同时利用荧光定量PCR方法检测ΔqoxB中鞭毛相关基因转录水平的变化。【结果】缺失qoxB基因后细菌在体外培养过程中生长能力没有差异,细菌的鞭毛运动能力显著降低,在30℃培养24 h和48 h后ΔqoxB运动圈直径分别较EGD-e下降35.86%和34.20%,且22个鞭毛相关基因转录水平显著降低。通过细胞感染试验发现缺失qoxB基因后细胞黏附、侵袭、增殖及胞内迁移能力均显著下降。【结论】本研究首次证实末端氧化酶亚基QoxB能降低单增李斯特菌的运动能力和对细胞的感染能力,此研究为进一步阐明末端细胞色素氧化酶影响单增李斯特菌的致病机制提供重要依据。     

单核细胞增多性李斯特菌氨基肽酶Lmo1711体外表达及其酶活分析

对单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)lmo1711基因编码的氨基肽酶进行克隆表达与纯化,并研究该重组蛋白的体外酶学特性。首先通过生物信息学分析预测Lmo1711与氨基肽酶家族成员的亲缘关系及关键活性位点的保守性。利用SWISS-MODEL模拟预测该蛋白的空间结构;构建Lmo1711原核表达载体并转化入E.coli Rosetta中,诱导表达重组目的蛋白,并利用镍离子亲和层析方法纯化目的蛋白;以氨基酸-对硝基苯胺偶联物为底物,Lmo1711通过水解底物N端氨基酸残基产生游离对硝基苯胺单体,405 nm处检测吸光值对该产物进行检测从而分析Lmo1711的酶学特性。在此基础上系统研究Lmo1711对不同氨基酸残基底物的催化特异性,及不同金属离子对该酶活性的影响。经原核表达纯化获得49.3 kDa的重组Lmo1711蛋白,与预测分子量一致;生物信息学分析推测Lmo1711属于M29氨基肽酶家族,且存在保守关键氨基酸活性位点(Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380);酶活分析显示,Lmo1711具有较强的氨基肽酶活性,针对不同底物的结合和催化能力差异较大,对亮氨酸残基的亲和程度最高;Lmo1711氨基肽酶活性具有金属离子依赖性,Co~(2+)、Cd~(2+)、Zn~(2+)等多种金属离子均能显著增强其活性,其中Co~(2+)的激活效应最显著。本试验首次发现并证实,单增李斯特菌Lmo1711属于M29氨基肽酶家族成员,具有较强的催化活性,且对金属离子具有不同程度的依赖性。     

基于荧光染料PicoGreen和核酸适配体的伏马毒素B1检测方法

伏马毒素B1是主要存在于玉米及玉米制品中的一种可以引起癌症的霉菌毒素。针对霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。本研究利用核酸适配体与伏马毒素B1结合后不再结合其互补核酸序列的选择性以及Pico Green与双链DNA结合的特异性,开发了一种快速检测伏马毒素B1的适配体方法。Pico Green与双链DNA反应15 min后激发产生的荧光达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。该方法的最低检测限为0.1μg/L(0.1 ppb),线性范围为0.1-1μg/L(0.1-1 ppb),整个检测流程可在40 min内完成。特异性试验显示伏马毒素B1适配体与黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等常见霉菌毒素无交叉反应。结果表明适配体方法与基于抗体的检测伏马毒素B1商品化ELISA试剂盒相当,Kappa值为0.857。由于核酸适配体比抗体成本低,检测时间短,因此基于核酸适配体的方法比基于抗体的ELISA方法更具有推广应用价值。     

单增李斯特菌溶血素O的PEST序列激活ERK1/2磷酸化的作用

[目的]本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的关键结构域PEST序列(包含S44、S48和T51关键磷酸化位点)突变体,并针对其生物学功能展开研究。[方法]以李斯特菌参考菌株EGD-e为模板扩增编码LLO的hly基因,克隆至pET30a(+)原核表达载体,在此基础上利用氨基酸突变技术获得表达PEST突变体(LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A)的重组质粒,转入E.coli Rosetta感受态细胞中,诱导表达重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用红细胞裂解试验检测重组蛋白的溶血活性,并通过Western blotting检测重组突变蛋白刺激Caco-2细胞后对MAPK关键信号分子ERK1/2磷酸化水平变化的影响。[结果]结果显示,本研究成功获得重组LLO及其突变体蛋白LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A。在pH5.5和7.4条件下,LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A均具有和LLO相当的溶血活性,说明PEST序列缺失或突变并不影响LLO的膜裂解活性。研究进一步发现,重组LLO及其突变蛋白刺激Caco-2细胞后均能激活ERK1/2的磷酸化。[结论]研究表明LLO的关键结构域PEST序列对于维持该蛋白的膜裂解能力及穿孔活性并非必需,且该结构域的缺失不影响李斯特菌在感染宿主时依赖LLO介导ERK1/2磷酸化的生物学过程。本研究将为进一步探索细菌感染过程中PEST序列对于LLO发挥生物学功能的潜在作用及分子机制奠定基础。     

单核细胞增多性李斯特菌硫氧还蛋白Lmo1609的应激生物学功能研究

[目的]本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)硫氧还蛋白Lmo1609的基因缺失株,分析Lmo1609的氧化还原酶学活性,及其在细菌生长、运动过程中发挥的作用,并探究了Lmo1609参与细菌抗氧化应激和致病的生物学基础。为阐明其抗应激生物学作用以及完善李斯特菌的感染机制奠定分子基础。[方法]利用同源重组原理构建lmo1609基因缺失株及回补株。通过分子生物学、应激生物学和感染生物学等手段,对Lmo1609的生物学功能进行探索。以胰岛素为底物分析其氧化还原酶学活性;通过构建lmo1609缺失株和回补株,比较野生株和突变株在运动性、生长能力、抗氧化应激、细胞黏附、侵袭和增殖能力等方面的差异,进而鉴定Lmo1609的生物学功能。[结果]缺失lmo1609后,单增李斯特菌在生长能力上无明显变化,而运动能力明显减弱;对H₂O₂的敏感性增强;对细胞的黏附侵袭能力没有差异;对小鼠的致病力没有显著影响。[结论]本研究首次证实了单增李斯特菌硫氧还蛋白Lmo1609具有还原酶学活性,参与调控细菌的运动和对H₂O₂的氧化应激耐受,不介导单增李斯特菌的致病性。     

单增李斯特菌毒力因子溶血素关键氨基酸位点在感染过程中的作用研究

【目的】探究单增李斯特菌溶血素O (listeriolysin O, LLO)中D3区域β8折叠片上第253位氨基酸(谷氨酰胺,Q)和第254位氨基酸(异亮氨酸,I)对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染生物学功能的影响。【方法】构建LLO_Q253A和LLO_I254A突变蛋白的原核表达菌株,以及利用同源重组方法构建hly_Q253A和hly_I254A突变株;通过表达纯化突变蛋白,测定溶血活性;比较LLO第253位Q和第254位I均突变成丙氨酸(A)后,对细菌体外生长能力、黏附侵袭、胞内迁移和增殖能力的影响。【结果】相应位点突变后,LLO蛋白均能够正常表达。在pH 6.5条件下,所有突变蛋白和突变株的溶血活性丧失。然而,在pH 5.5条件下,LLO_I254A和hly_I254A恢复了溶血活性。与野生株相比,突变株的体外生长、黏附能力和胞内增殖能力均无明显差异;突变株的侵袭能力和胞间迁移能力显著低于野生株。【结论】本研究证实第253位Q和第254位I均突变成A后,单增李斯特菌在pH 6.5条件下丧失溶血活性,并降低了感染宿主细胞的能力,但具体机制还有待进一步探索。本研究为深入探究LLO结构对单增李斯特菌生物学功能的影响奠定基础,对单增李斯特菌点突变株的构建具有一定参考意义。     

细菌金属离子外排系统及金属稳态调控

铁、铜、锌、锰等金属离子是各类生物体生存和增殖所必需的微量元素,可影响生物体内蛋白酶活性、免疫反应、生理过程和抗感染机制。细菌感染过程中,宿主可通过限制或提高体内环境中金属离子的浓度来抑制细菌增殖,与此同时,细菌进化出各种转运系统以适应宿主体内金属离子水平的变化。由于不同细菌的金属离子外排系统在结构和生化特性上存在变异,它们呈现出独特的金属离子外排模式。本文根据现有文献报道及本团队研究结果,对铁、铜、锌和锰离子的细菌外排系统进行讨论和总结,旨在综述目前对细菌金属离子稳态调控机制研究进展的认识,为深入理解细菌金属稳态调控相关机制提供参考。     

单核细胞增多性李斯特菌谷胱甘肽还原酶GR的生物学特性

【目的】本文旨在构建单核细胞增多性李斯特菌谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)基因lmo1433(gr)缺失株,并研究GR在细菌生长和运动过程中发挥的作用及与谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx)系统间的调控关系,探究GR参与细菌抗氧化应激和致病力的生物学功能,为阐明氧化还原蛋白介导细菌环境适应和宿主内感染的机制奠定分子基础。【方法】利用细菌遗传操作系统构建获得gr缺失株及回补株后,通过分子生物学和感染生物学手段,比较野生株和突变株的运动性、生长能力、抗氧化应激、细胞黏附、侵袭和增殖能力;利用整合型质粒构建带GR启动子的荧光报告系统,并结合荧光定量分析GR受Grx调控的情况。【结果】缺失gr后李斯特菌在体外培养基中的生长能力未受明显影响,但在半固体培养基中的运动能力却显著增强;缺失gr后细菌在铜离子、镉离子以及肼中抗氧化应激能力增强,在H_2O_2中无差异;缺失gr后细胞黏附、侵袭和增殖能力均显著增强;荧光报告系统定量分析发现grx缺失后gr的启动子活性显著增强,表明Grx参与对GR的转录负调控。【结论】本研究首次证实了单增李斯特菌谷胱甘肽还原酶GR能调控细菌的运动能力,并且缺失GR增强了李斯特菌的抗氧化应激和感染宿主能力;首次证实了GR的自身转录受Grx负调控,但具体分子机制有待于深入探究。本研究有助于深入理解单增李斯特菌氧化还原蛋白的调控关系以及通过参与诸多生物学过程介导细菌体外环境适应及宿主内感染的分子机制,为防控胞内菌感染提供了新策略。     

单核细胞增多性李斯特菌谷胱甘肽合成酶调控鞭毛形成研究

[目的] 本试验旨在构建单核细胞增多性李斯特菌谷胱甘肽合成酶基因gshF缺失株和互补株并研究其在细菌运动和鞭毛形成中的调控作用。[方法] 采用同源重组的方法构建得到gshF缺失株后,测定野生株及缺失株的运动性和体外生长能力;同时利用荧光定量PCR方法检测gshF缺失株中鞭毛相关基因转录水平的变化。[结果] 缺失gshF后细菌在体外培养基中的生长能力未受影响,但缺失株的运动性及鞭毛形成能力显著降低。此外,缺失株中鞭毛形成重要调控基因gmaR以及鞭毛结构元件基因flaA的转录水平显著低于野生株,而其他鞭毛相关基因的转录水平变化不明显。[结论] 研究首次表明单增李斯特菌谷胱甘肽合成酶通过调控鞭毛重要基因的转录进而影响细菌的运动性和鞭毛形成,研究有助于深入理解重要食源性胞内菌通过精确调控鞭毛形成以适应外界和宿主环境的分子机制。