2017–2019年我国南方地区高致病性H5N6亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析

【背景】自2014年以来,H5N6禽流感病毒在我国家禽和活禽市场持续进化,成为人类和动物健康的重大威胁。【目的】对2017-2019年中国南方地区93株高致病性H5N6禽流感病毒的HA基因进行分子进化分析。【方法】接种9-11日龄鸡胚分离核酸检测阳性的H5N6标本,运用下一代测序平台对病毒分离物进行全基因组测序,从NCBI和GISAID数据库下载参考序列,利用BLAST、MEGA6.1及Clustal X等软件进行序列分析。【结果】2017-2019年,从189份江苏省H5亚型禽类/环境标本和1名H5N6患者咽拭子标本中共分离到43株病毒,完成了33株H5N6病毒的全基因组测序。下载网上同时期中国其他地区流行的H5N6毒株序列,对总计93株H5N6病毒的HA基因进行分子进化分析。93株H5N6病毒中有78株属于Clade 2.3.4.4h,9株病毒属于Clade 2.3.4.4e,4株H5N6病毒属于Clade 2.3.4.4b,1株属于Clade 2.3.4.4f,1株属于Clade 2.3.4.4g。所有93株病毒HA蛋白的裂解位点含有多个碱性氨基酸,表明它们都属于高致病性禽流感病毒。所有93株病毒HA蛋白的Q222和G224位氨基酸没有发生突变,保留了禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)结合特性;158位点丧失糖基化,同时124位出现一个新的潜在糖基化位点。【结论】2017-2019年间中国南方地区H5N6病毒进化活跃,具有明显的基因多样性,需要加强对病毒分子进化的监测。     

猪流感病毒进化方式及其流行特点

摘要：猪在甲型流感病毒生态分布和遗传进化中占有重要地位。猪的呼吸道上皮同时具有禽和人流感病毒2种类型的受体,因此人和禽流感病毒都可以感染猪,猪被认为是禽、人流感病毒的中间宿主和不同来源流感病毒的基因“混合器”。猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV）的进化方式包括基因重配、抗原漂移和宿主适应性进化,其中基因重配是主要进化方式。与人类季节性流感病毒相比,SIV在全球的流行情况各不相同,呈地方流行性,并具有明显的地区差异。全球范围内流行的SIV亚型主要有3种：H1N1、H3N2和H1N2亚型,其中各亚型内病毒基因来源又不尽相同。欧洲、北美及我国猪群中流行的流感病毒在遗传进化和基因来源方面各具特色。目前欧洲猪群中流行的主要是类禽H1N1、H1N2和H3N2病毒,其中后两者是基因重配病毒。从1998年开始,古典猪H1N1、“人-猪-禽”三源基因重配H3N2、H1N1和H1N2病毒共存于北美的猪群中,其遗传变异日趋复杂。在基因进化上,欧洲和北美基因重配的SIV是目前新的人类大流感病毒-“甲型H1N1病毒”-的母源病毒。我国猪群中流感病毒主要是古典猪H1N1和类人H3N2病毒,但近年来在我国猪群中分离到遗传上与欧洲和北美SIV高度相关的病毒,提示我国SIV的进化趋势值得关注。1970年代以来,全球已报道了50多起人感染SIV事件,表明SIV也是一种值得重视的人兽共患病,预示了SIV可能成为人类大流感毒株或为大流感毒株提供基因。鉴于SIV在甲型流感病毒生态学上的重要意义,以及对人类公共卫生的潜在威胁,建议应尽早启动我国SIV的常规监测工作,密切关注SIV的流行动态,掌握其分子遗传进化规律。同时,将SIV的监测工作纳入整个流感病毒（人和动物流感病毒）的监测网络,在信息上实现共享,从生态学的高度把握我国流感病毒的流行和进化趋势,这对保护动物健康和预防人类大流感都有重要意义。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

一例混合感染中H3N2和H7N9流感病毒的分子遗传特性

【目的】揭示一例混合感染中H3N2和N7N9流感病毒的分子遗传特性。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测。通过二代测序技术对病毒分离物进行全基因组测序分析。【结果】2013年4月在南京市检测到一例人季节性H3N2流感病毒和禽流感H7N9病毒混合感染,混合病毒分别命名为A/Nanjing/M1/2013 (H3N2) (M1-H3N2)和A/Nanjing/M2/2013 (H7N9) (M2-H7N9)。分离株M2-H7N9 HA蛋白的Q226L位点和PB2蛋白E627K位点发生突变,增强了病毒对人体的感染能力。【结论】报道了一起人混合感染H3N2和N7N9流感病毒病例,提示人可能成为流感病毒基因“混合器”,应高度关注H7N9病毒与人季节性流感病毒的基因重配现象。     

2019-2020年苏中地区某活禽市场H9N2禽流感病毒分子进化

【背景】20世纪90年代以来,H9N2禽流感病毒成为危害我国养禽业及人类健康和公共卫生的重要病原。【目的】了解苏中地区2019-2020年活禽市场H9N2禽流感病毒的分子进化特征。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测,原始标本用SPF鸡胚进行病毒分离,用特异性引物对病毒分离物进行全基因组测序,利用BLAST、ClustalX和MEGA6等软件进行序列比对和系统发育分析。【结果】2019-2020年间从苏中地区某农贸市场采集到231份环境和禽类标本,共检出34份甲型流感病毒,其中33份为H9N2亚型。阳性标本接种SPF鸡胚,分离到20株H9N2病毒。对其中11株病毒进行全基因组测序,系统发育分析表明11株病毒的HA和NA都属于H9N2禽流感Y280-like系的G57基因型。根据HA和NA的进化特征,11株病毒可分为5个基因组合(A、B、C、D和E),其中A (n=5)是优势流行基因组合。11株H9N2分离病毒的HA蛋白HA1和HA2亚单位的裂解位点是一个碱性氨基酸R,具有低致病性禽流感病毒的特征。HA蛋白的受体结合部位有4个氨基酸位点(I155T、H183N、A190...     

套式RT-PCR方法检测临床样品中的猪流感病毒

猪流感是由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的一种呼吸道传染病,具有发病率高、死亡率低的特点,罹患流感的怀孕母猪还有并发流产的危险.猪流感已给我国养猪业带来严重危害.     

套式RT—PCR方法检测临床样品中的猪流感病毒

猪流感是由猪流感病毒(Swine influenza vi rus, SIV)引起的一种呼吸道传染病,具有发病率高、死亡率低的特点,罹患流感的怀孕母猪还有并发流产的危险。猪流感已给我国养猪业带来严重危害。SIV属于正粘病毒科 A 型流感病毒属[1]。A型流感病毒可感染多种动物,一般认为,水禽是流感病毒的自然宿主和基因库,猪则是人流感病毒株与禽流感病毒株的中间宿主和混合器[1],通过基因重配产生抗原转移而导致新流感病毒株的出现。研究病毒两种受体[2],因此所有A型流感病毒都能感染猪,猪在流感病毒的生态分布中占有重要地位。目前猪流感的主要流行血…     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株ＱＤ免疫原Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了克隆、序列分析和ＤＮＡ免疫的初步研究。ＲＴＰＣＲ扩增ＱＤ毒株的Ｓ１基因,将其５′和３′端分别进行分子修饰后插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国ＩＢＶ毒株Ｓ１全基因核酸探针与ＱＤ毒株Ｓ１基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用ＨａｅⅢ,ＰｖｕⅡ和ＸｂａⅠ等限制酶对此流行毒株Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了酶切分析;在测定ＱＤ毒株Ｓ１基因５′端高变区核苷酸序列并以此与ＩＢＶＭ４１,Ｈ１２０,６／８２及Ｂｅａｕｄ等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了ＱＤ株Ｓ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,ＩＢＶＳ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

江苏首例甲型H1N1(2009)流感病毒分离及其血凝素分子遗传特征分析

2009年6月12日,江苏确诊首例甲型H1N1(2009)病例。通过细胞和鸡胚分离系统,我们分离到一株具有较高血凝活性的病毒,命名为A/Jiangsu/1/2009。为了跟踪病毒的变异情况,我们开展了病毒的全基因组测序工作,在此基础上对其血凝素基因(Haemagglutinin,HA)的遗传特性进行了详细研究。分离株HA蛋白不具有多碱基HA裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与参考株A/California/04/2009相比,分离株A/Jiangsu/1/2009HA蛋白的有4个氨基酸发生了突变,但都不在已知的抗原位点上。分离株有5个潜在糖基化位点,这与近年来古典猪H1N1和北美三源重配猪H1病毒完全一致,保留了古典猪H1的特点。与禽流感H1病毒相比,分离株HA蛋白受体结合位点上的E190D和G225D发生突变,这可能成为新甲型H1N1(2009)在人际间传播的一个重要分子基础。此外,其它受体结合位点上相关氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。本研究首次对早期流行的甲型H1N1(2009)流感病毒的HA蛋白的分子遗传特征进行了详细研究,对进一步监测病原变异具有重要指导意义。     

猪流行性感冒病毒H3N2亚型体外诱导猪肺巨噬细胞发生凋亡

本文旨在探讨H3N2亚型猪流行性感冒病毒(SIV)引起机体免疫抑制的机制.用SIV分离株体外感染猪肺巨噬细胞(PAM),发现SIV可在PAM中进行生产性复制.感染后96 h,病毒的血凝效价达到64.琼脂糖凝胶电泳显示,感染细胞的DNA呈"梯样"图谱;流式细胞仪检测显示,细胞在感染后24 h出现明显的亚二倍体DNA峰,72 h凋亡细胞达25%.光学显微镜和电子显微镜下可见感染细胞的形态发生特征性改变,如细胞皱缩、细胞表面微绒毛消失、胞质内出现大量空泡、细胞核染色体发生浓缩等.结果提示,SIV可在体外诱导PAM凋亡,推测PAM凋亡可能是SIV引起机体免疫抑制的重要因素之一.