郑州市绿地结构对气候调节因子的影响及启示

基于高精度遥感影像及夏秋季微气候数据, 应用相关分析、主成分分析、地理加权回归等方法研究了郑州市主城区绿地结构与微气候调节因子的相关关系空间分异特征。结果表明, 绿地斑块的分散程度、优势程度以及形状复杂程度在研究区大部分空间显著影响微气候调节功能。在研究区中, 西北、西南、中北、中南的绿地斑块的分散程度越小, 东北部优势绿地斑块的优势程度越大, 东北部、西部的绿地斑块的形状复杂程度越大, 则相应空间范围内夏季气温的降温效果越明显; 西北、南部绿地斑块的形状复杂程度越大, 东部优势绿地斑块的优势程度越小, 则相应空间范围内秋季空气比湿的增湿效果越明显; 西北、西南部绿地斑块的形状复杂程度越大, 南部、东部优势斑块的优势程度越小, 秋季风速的降速效果越明显, 反之, 则可以提高相应区域的风速。     

软腐白菜细菌群落结构多样性与生长环境的相关性

[目的]通过对比分析不同生境白菜软腐病变组织与根系土壤相关细菌的群落结构,探讨白菜软腐细菌种群的多样性,以及与生境土壤细菌种群的相关性.[方法]样品采自河南省2个不同生态型白菜田,以成熟白菜软腐组织及病株根系土壤为目标,利用模拟原环境的培养基成分和条件,对样品中的细菌进行高通量分离培养和细胞16S rRNA基因序列比对分析,获得各样品细菌种群结构及其丰度,进而对各样品的优势菌群进行对比分析.[结果]两种不同生境白菜软腐组织细菌总量M05T为4.0×l0s cell/g、Q2T为1.2×1011 cell/g,分别获得纯菌56株和85株.M05T优势菌为萎蔫短小杆菌萎蔫亚种(Curtobacterium flaccunfaciens pv.Flaccumfaciens);Q2T优势菌为假单胞菌(Pseudomonas spp.)(柄木槿假单胞菌(P.hibiscicola)、台湾假单胞菌(P.taiwanensis)、托木尔假单胞菌(P.tuomuerensis)、莫塞尔假单胞菌(P.mosselii)).根系土壤细菌总量M05S为2.7 × 105 cell/g、Q2S为6.2 × 107 cell/g,分别获得纯菌36株和70株.M05S优势菌为巨大芽胞杆菌(Bacillus megatherium);Q2S优势菌为假单胞菌(Pseudomonas spp.)(香鱼假单胞菌(P.plecoglossicida)、栖木槿假单胞菌(P.hibiscicola)、类黄色假单胞菌(P.parafulva)、蒙氏假单胞菌(P.monteilii)、膝形假单胞菌(P.geniculata)).[结论]依据不同生境的白菜软腐组织和根系土壤细菌群落结构对比分析,认为白菜软腐菌可能具有多样性和多种致病来源,本研究为软腐病多种防治措施的制定提供基础研究和菌种资源.     

热带假丝酵母高效利用甘油研究

目的:热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率。方法:以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶(gk)为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因(kanr)连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP。结果:经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4%,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1%,表明启动子替换能促进C.tropicalis1798对甘油的吸收利用。此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7%。结论:通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率。     

热带假丝酵母ctpxa1基因缺失菌的构建及对长链二元酸积累的影响

Pxa1p为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae过氧化物酶体上的膜蛋白,与Pxa2p组成二聚体,参与转运长链脂肪酸进入过氧化物酶体过程。热带假丝酵母能够发酵烷烃和脂肪酸生产长链二元酸,而过氧化物酶体中发生的β-氧化会消耗产生的长链二元酸造成产率降低。本研究以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798为宿主菌,通过基于PCR片段的同源单交换法,快速构建ctpxa1基因敲除菌株C.tropicalis 1798-pxa1。利用半定量RT-PCR技术,检测ctpxa1基因在C.tropicalis 1798、C.tropicalis 1798-pxa1的表达量,灰度值比值为2.03,表明ctpxa1在C.tropicalis 1798-pxa1中的表达被弱化。经144 h发酵,C.tropicalis 1798-pxa1比C.tropicalis 1798的十二碳二元酸产量明显提升,其产出浓度为10.3 g/L,比野生型菌株C.tropicalis 1798提高了94.3%。     

葡萄糖氧化酶在枯草芽孢杆菌芽孢表面的展示及其酶电极制备

葡萄糖生物传感器是目前最为常见的电化学生物传感器,绝大多数葡萄糖生物传感器采用在电极表面修饰葡萄糖氧化酶的方法来制备,但是,在电极的固定化过程中需要酶的纯化,使得成本增加,已成为固定化酶电极开发领域的瓶颈。文中主要以芽孢衣壳蛋白CotX为锚定蛋白将葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase,GOD) 展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面,通过Western blotting分析、免疫荧光分析以及酶活检测均证明GOD在芽孢表面有效表达,发酵获得重组芽孢 (Spore-GOD)。再采用滴涂法和电沉积法制备了氧化石墨烯/普鲁士蓝沉积膜修饰玻碳电极,将Spore-GOD固定在修饰电极表面,最后滴加一层Nafion溶液,制成了电化学生物传感器,用于葡萄糖的灵敏测定。葡萄糖在该酶电极传感器上的循环伏安图表明,该反应在0.42 V处出现明显的氧化峰,并且氧化还原峰电流与葡萄糖浓度在0.1–7.0 mmol/L之间具有良好的线性关系,校正曲线方程为：I=1.304 7Cglucose+3.639 (R2=0.992 9),其检测限为7.5 μmol/L (S/N=3)。此修饰电极具有良好的导电性能、稳定性和重现性,可用于葡萄糖的分析测定。     

一种基于单交换原理的地衣芽孢杆菌基因敲除方法及应用

目的：基于同源单交换原理构建地衣芽孢杆菌基因快速敲除方法,提高基因敲除效率。方法：以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）20085内切纤维素酶基因celb为拟敲除对象,利用重叠PCR技术将celb基因内约500bp片段与氯霉素抗性基因（Cm^r）相连接,经末端单酶切后电转化至B.licheniformis 20085感受态细胞中,仅通过一次同源单交换,将抗性基因Cm^r插入至celb基因内部,实现目的基因的敲除。结果：经过氯霉素抗性筛选和基因组PCR鉴定,成功获得celb基因缺失菌株B.licheniformis 20085Δcelb;发酵验证结果显示,B.licheniformis 20085Δcelb较原始菌株滤纸崩解能力显著降低,其中发酵60h后内切纤维素酶（CMC酶）活力由1.86U/ml降低至0.50U/ml,表明celb基因在地衣芽孢杆菌降解纤维素的过程中起着重要作用。结论：通过重叠PCR技术结合同源单交换原理能够实现地衣芽孢杆菌目的基因的快速敲除,为该菌株甚至其它微生物提供了一种基因功能快速鉴定的手段。     

海藻糖合酶在毕赤酵母表面的展示

海藻糖合酶能够利用麦芽糖一步法转化生产海藻糖,其底物专一性较高,该酶体系生产工艺简单,不受底物麦芽糖浓度的影响,是工业生产海藻糖的首选。为获得具有生产海藻糖合酶能力的毕赤酵母表面展示载体,实验以筛选的Pseudomonas putide P06海藻糖合酶基因为模板,PCR扩增得到海藻糖合酶基因(tres,2064 bp),连接至pPICZαA质粒中,获得重组质粒pPICZαA-tres。以来自酿酒酵母的共价连接细胞壁的Pir系列蛋白的Pir1p成熟肽蛋白作为毕赤酵母表面展示的锚定蛋白,利用PCR技术扩增得到pir1p(847 bp),连接至重组质粒pPICZαA-tres中,获得重组质粒pPICZαA-tres-pir1p。将重组质粒电击转入毕赤酵母GS115中,利用α-factor信号肽将蛋白引导分泌至细胞壁展示于毕赤酵母表面。通过Zeocin抗性筛选,挑选出阳性克隆子并摇瓶发酵。发酵产物经离心、破碎并使用昆布多糖酶水解,洗脱,结果显示,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可见明显融合蛋白条带,表明海藻糖合酶已成功地锚定在毕赤酵母。将重组毕赤酵母使用pH 7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在30℃~60℃水浴条件下作用2 h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到酶学活性。在优化后的条件pH 7.5,50℃,表面展示海藻糖合酶酶活达到300.65 U/g。40℃~50℃酶活较稳定,保温60 min,残留酶活相对活力达75%以上;最适反应pH值为7.5,并在碱性环境下稳定。     

拟南芥硫酯酶基因在毕赤酵母中的表达

硫酯酶在生物体内能催化水解脂酰酰基载体蛋白和饱和脂肪脂酰链,对中链脂肪酸(Medium chain fatty acids,MCFAs)的积累起着关键作用。为获得具有生产中链脂肪酸能力的工程菌,以拟南芥c DNA为模板,PCR扩增得到其脂酰-ACP硫酯酶基因At Fat A,经Eco RⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的质粒中,获得重组质粒p PICZαA-At Fat。将重组质粒电击转入毕赤酵母GS115中,通过Zeocin抗性筛选,挑选出阳性克隆子并摇瓶发酵诱导,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析获得明显目的蛋白条带,首次成功构建At Fat A的真菌表达系统。气质联用法检测发酵产物胞外游离脂肪酸,发现毕赤酵母At Fat A重组菌株比起始GS115菌株胞外游离MCFAs(主要是辛酸)产量增加51%,MCFAs产量占胞外总脂肪酸产量的28.7%,而野生菌中这一比例仅有18.1%,这为日后生产安全无毒害的MCFAs探索了一条新的途径。     

基于核酸适配体的肿瘤免疫治疗进展

肿瘤免疫治疗是通过调节机体的免疫功能来控制和杀伤肿瘤的一种治疗手段。针对免疫检查点的治疗等一系列临床突破使得肿瘤的免疫治疗受到了广泛重视。目前,抗体治疗和过继性细胞治疗是肿瘤免疫治疗的主要方式,但是这些方法仍具有副作用较强,实体瘤治疗难以实现,治疗费用高昂等缺点。因此改进和发展更加高效、安全、低成本的新技术仍十分必要。适配体是利用指数富集的配体系统进化技术筛选得到的单链寡核苷酸,有核酸"抗体"之称。适配体具有低免疫原性、组织穿透力强、易于化学合成与修饰等优势,且与其靶标的结合具有较好亲和力和特异性,可像抗体一样实现肿瘤的免疫治疗。对适配体在肿瘤免疫治疗相关技术中的新应用作一综述,主要包括基于免疫检查点的抗肿瘤作用、双特异性适配体的肿瘤免疫治疗、适配体靶向递送siRNA的肿瘤免疫治疗和适配体联合抗体的肿瘤免疫治疗等方面。     

以CotC为分子载体在枯草芽孢杆菌表面展示海藻糖合酶

海藻糖是自然界中普遍存在的一种非还原性双糖,是一种极好的天然干燥剂和保鲜剂。海藻糖合酶能够催化α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖,是生产海藻糖的首选。为获得具有良好展示效果的海藻糖合酶,将其高效稳定的展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面,实验同时分别选取增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和海藻糖合酶(Tres)作为模型蛋白,以来自枯草芽孢杆菌的芽孢衣壳蛋白Cot C作为枯草芽杆菌表面展示的锚定蛋白进行表面展示研究。利用流式细胞仪分析EGFP在芽孢表面展示的情况,结果表明芽孢衣壳蛋白Cot C可以将EGFP固定在芽孢的表面。然后将荧光蛋白基因egfp通过酶切替换为海藻糖合酶基因tres,将重组菌株使用p H7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在50℃水浴条件下作用2h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到海藻糖峰,通过计算得到的酶活为252U/ml。说明海藻糖合酶基因通过与芽孢衣壳蛋白Cot C融合后可被展示在芽孢的表面。