嗜水气单胞菌菌落多重PCR方法的建立及应用

[背景]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对水产动物、畜禽和人类均有致病性。基因表达的溶血素、气溶素和肠毒素是重要毒力因子,在致病性嗜水气单胞菌早期检测及防治中尤为重要。目前采用菌落直接提取DNA用于多重PCR研究的相关报道较少。[目的]基于菌落PCR方法建立针对嗜水气单胞菌溶血性基因、肠毒素基因和16S rRNA基因特异性片段(5个基因片段)的多重PCR快速检测方法。[方法]采用选择性RS (Rimler-Shotts)培养基对样品中嗜水气单胞菌有效富集分离和辨认,建立并优化嗜水气单胞菌16S rRNA、ast、alt、aerA、act这5个基因的多重PCR方法,比较菌落PCR中DNA模板不同提取方法对多重PCR扩增结果的影响,并检测该方法对维氏气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌的特异性。[结果]通过对RS培养基上单菌落的16S rRNA基因鉴定,初步判定嗜水气单胞菌和其他可培养菌的菌落形态,对其富集程度进行可视化辨别。多重PCR反应体系优化结果显示,引物浓度最优配比为16S rRNA:ast:alt:aerA:act=1:2:2:3:4。菌落PCR结果显示,...     

溪蛉科研究进展

溪蛉是脉翅目中比较稀少的一个类群,可以作为天敌资源和研究昆虫演化的"活化石"材料,但历史上溪蛉科在脉翅目中的系统地位一直是个颇具争议难以解决的问题。本文综述了溪蛉科国内外分类研究简史,探讨了溪蛉科的地理分布,以及溪蛉科生物学、化石等其他方面的研究进展。最后提出了溪蛉科分类研究中亟须解决的几个问题并呼吁应该加强对其应用价值的研究。     

诺如病毒GII.6 P粒子原核表达与纯化

原核表达的诺如病毒(Noroviruses,NoV)衣壳蛋白亚基P粒子与No V有相同的抗原类型,可以代替NoV在体外进行结合,这对于研究该病毒与宿主和环境载体结合的相关机理有重大意义。本研究成功构建GII.6 P粒子基因表达载体,并对原核表达体系中诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间进行优化。结果表明表达载体在22℃、2×10~(-4)mol/L IPTG诱导22 h后表达量最高。随后,在亲和层析的基础上结合阴离子交换以及凝胶过滤层析对表达产物进行纯化,最终获得高纯度GII.6 P粒子。     

黄土高原的一个VA菌根真菌新种：三红盾巨孢囊霉

在黄土高原中条山区发现一个盾巨孢囊霉属新种,其孢子无色透明,但球茎状连孢菌丝、芽盾及发芽菌丝均呈明显的红棕色,故命名为三红盾巨孢囊霉Scutellosporatrirubiginopa X．L. Pan & G. Y．Zhang 近似种 S. gilmorei Walker ＆ Sanders(1986)和S scutata Walker ＆ Diederichs(1989),在许多方面均不同于此新种。标本藏于山西省农科院棉花研究所。     

家蚕浓核病毒Bm DNV-3（中国株）VD 1基因组结构与转录分析

为了进一步认识家蚕浓核病毒_BmDNV-3（中国株）VD₁基因组的结构和功能,VD1被分离、纯化、克隆到pUC119载体上,完成了基因组全序列的测定。序列分析显示VD₁基因组全长为6543个核苷酸,末端拥有224个核苷酸反向重复序列（ITRs）。VD₁基因组正链含有3个大的开放阅读框（ORF1-3）,负链含有1个大的开放阅读框（ORF4）。比较BmDNV-3的 VD₁和BmDNV2 (Yamanashi isolate) 的VD₁基因组全序列,两者同源性为98.4%,并且有107个碱基的替代和1个碱基插入,氨基酸突变集中在VD₁ ORF3和VD₁ORF4。Northern杂交结果显示：VD₁的左边正链上有1.1kb和1.5kb两个转录本,右边的负链上有一个3.3kb转录本。3′和5′-RACE结果显示：1.1kb转录本开始于nt 290,结束于nt 1437;1.5kb转录本开始于nt 1423,结束于nt 2931;3.3kb转录本开始于nt 6287,结束于nt 2922。 正链上15kb转录本和负链上3.3kb转录本拥有10个核苷酸的3′端的共同序列。研究结果显示该病毒基因转录与已报道的其它浓核病毒存在较大的差异性。     

热应激对虹鳟CRT基因和PDIA4基因mRNA表达的影响

在转录组测序研究中,筛选出了与虹鳟热应激相关的钙网蛋白基因CRT和蛋白二硫键异构酶基因PDIA4。为研究其在热应激过程的表达变化规律及应答机制,本试验以全同胞虹鳟为研究对象,通过持续升温,分别在18℃(对照组)、21℃、23℃、24℃、25℃和26℃下随机挑选3尾虹鳟,采用实时荧光定量(Real-time FQ-PCR)方法测定并分析了肝脏和头肾CRT和PDIA4 mRNA的表达变化特征。结果显示,与18℃相比,肝脏、头肾CRT表达量分别在24℃、26℃时显著上调且达到最高(19.16倍和2.76倍, p0.05);PDIA4 mRNA表达量分别在25℃、26℃显著上调且达到最高(57.45倍和188.68倍, p0.05)。肝脏CRT的表达量在24℃和25℃时显著高于头肾(10.89倍和8.46倍, p0.05),而PDIA4表达量在24℃、25℃和26℃时显著低于头肾(p0.05)。因此认为,热应激诱导虹鳟肝脏、头肾中CRT和PDIA4 mRNA的表达上调,25℃以上时,虹鳟热应激反应强烈,且对基因表达水平的影响存在组织特异性,肝脏对热刺激的反应比头肾更敏感。本研究为阐述鱼类在热应激下适应性保护机制提供指导。     

欧文氏弧菌毒力蛋白PirAB的原核表达与纯化

对虾肝胰腺坏死病的爆发造成了对虾养殖产业的严重亏损。从上海地区凡纳滨对虾中分离出1株欧文氏弧菌(Vibrio owensii SH-14),该菌株可导致凡纳滨对虾死亡,且死虾出现对虾肝胰腺坏死病的典型症状。经PCR扩增欧文氏弧菌毒力蛋白PirA与PirB对应基因序列,并将其连接到表达质粒pET-21b(pirA)和pGEX-4t-1(pirB)。通过优化诱导表达和亲和层析纯化条件,最终获得大量高纯度的目的蛋白。经冷冻干燥保存为后期抗体合成以及进一步毒力效应研究提供参考。     

黄土高原的VA菌根真菌Ⅳ.

红色盾巨孢囊霉（S.erythropa）和珊瑚囊盾巨孢囊霉（S.coralloidea）为中国新记录种。考察过的样片保存在山西农科院棉花研究所。     

海洋病毒荧光显微计数法的优化与应用

【目的】建立一种快速、稳定、可靠的海洋病毒计数方法。【方法】海水水样经福尔马林固定后,滤过孔径为0.02μm的Anodisc Al2O3膜。滤膜经SYBR Green I染色后,在相应波长的激发光下进行观察。借助荧光显微镜目镜网格尺,计数视野中的病毒颗粒,换算后获得样品中病毒的浓度。【结果】对具体实验方法进行了优化,可快速、稳定地对海水中的病毒计数。【结论】建立了一种适用于国内实验条件的、可靠的海洋病毒计数方法。     

盐单胞菌DSM 16354T中新型耐盐基因的克隆及解析*

目的: 嗜盐菌分布广泛且适应能力极强,为加强对嗜盐菌耐盐机制的探索与研究,从盐单胞菌Halomonas alkaliphila DSM 16354^T中筛选出潜在的与耐盐有关的基因,对其进行生物信息学分析,并验证相关蛋白的生理功能。方法: 利用基因文库筛选和功能互补相结合的方法,通过与大肠杆菌(Escherichia coli)盐敏感缺陷株KNabc(ΔnhaA、ΔnhaB、ΔchaA)的耐盐功能互补实验,筛选出具有耐盐功能的蛋白编码基因,并通过荧光猝灭恢复实验测定蛋白的逆向转运活性以及底物亲和力。结果: 筛选得到两个具有耐盐功能的蛋白编码基因,生物信息学分析结果表明该基因编码来自于DUF1538(domain of unknown function with No.1538 family)家族功能未知的膜蛋白,分别命名为duf1和duf2。系统发育树分析结果表明,来自盐单胞菌DSM 16354^T中的DUF1、DUF2属于一个独立的分支,预测这两个蛋白可能是DUF1538家族转运蛋白的新成员。对DUF1和DUF2的生理功能进行分析,发现duf1和duf2单独表达时均不具有耐盐碱能力,而共同表达时则表现出显著的耐盐碱功能,表明DUF1和DUF2两个亚基共同支持了蛋白的耐盐碱功能。蛋白的逆向转运测定活性结果表明双组份蛋白DUF1-2具有Na⁺(Li⁺、K⁺)/H⁺逆向转运活性。结论: 筛选得到的基因duf1和duf2共同表达时具有盐碱耐受功能以及逆向转运蛋白活性,这为筛选出新的DUF1538家族转运蛋白基因和进一步探究DUF1538家族转运蛋白功能奠定了基础。