牛分枝杆菌 MPB63基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌 Vallee111 染色体 DNA 为模板,以 MPB63 成熟蛋白基因特异性引物进行 PCR 扩增,获得约 400 bp 的 DNA 片段 . 通过 T-A 克隆技术,将 PCR 产物克隆至 pGEM-T Vector 中,成功地构建出克隆载体 pGEM-T-63. 以 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切 pGEM-T-63 和 pET28a(+) ,并将纯化的 MPB63 基因亚克隆至 pET28a (+) 中,构建出原核表达载体 pET28a-63. 将 pET28a-63 转化至感受态 E.coli BL21(DE3) 中,经 IPTG 诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,可见约 18 ku 外源蛋白带 . 蛋白质印迹分析发现,该蛋白质具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究 MPB63 的亚单位疫苗及 DNA 疫苗奠定基础 .     

牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB51成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。通过TA克隆技术,将PCR产物克隆至pGEMT Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEMT51。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEMT51和pET28a(+),并将纯化的MPB51基因亚克隆至pET28a (+)中,构建出原核表达质粒pET28a51。将pET28a51转化至感受态E.coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导和SDSPAGE分析,可见约30kD外源蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB51的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。     

中国地鼠线粒体DNA 16S rRNA基因序列分析及分子系统发育研究

目的通过克隆分析中国地鼠16S基因的部分序列,对中国地鼠16S基因的结构和功能进行初步探索和揭示。方法从GenBank中已报道的啮齿动物16S基因保守区设计一对引物,进行PCR扩增,测序。用Blastn与GenBank中七种啮齿类动物的16S基因进行序列比较,分析其碱基组成及变异情况,并用邻接法(NJ)、非加权组平均法(UPGMA)构建分子系统树,在分子水平上探讨中国地鼠和其他啮齿类动物的进化关系,对中国地鼠的种属地位进行了进一步验证。结果获得了中国地鼠线粒体16S基因的部分序列,其碱基组成A、T、C、G分别为40.5%、24.5%、18.7%、16.3%,与其他七种啮齿类动物的碱基含量相比,各碱基含量基本相似。NJ进化树表明,中国地鼠、金黄地鼠与欧洲仓鼠先聚为一支,小鼠与大鼠先聚为一支,东方田鼠、台湾田鼠与东欧田鼠先聚为一支。结论中国地鼠和金黄地鼠的亲缘关系最近,与传统的分类地位基本吻合。     

反基因锁核酸体外阻断乙肝病毒前S2基因表达

目的:探讨针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用.方法:针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区,分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以半乳糖配体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和酶联免疫法(ELISA)分别监测1、3、5和7d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S2抗原的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果:加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S2抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7d后抑制率分别达61.56％、68.18％和72.82％.各实验组与对照组比较差异均具有统计学意义(均P＜0.05).LNA对细胞代谢无明显影响.结论:针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据.     

人骨髓间充质干细胞分化为运动神经元过程中Nestin与Hb9表达的研究

目的探讨全反式维甲酸(RA)与音猬因子(Shh)诱导人骨髓间充质干细胞向神经干细胞乃至运动神经元方向分化过程中Nestin与Hb9的表达变化情况。方法采用传至第3代的人骨髓间充质干细胞,经含有RA与Shh的诱导液处理后,应用免疫细胞化学及荧光定量PCR方法分析Nestin与Hb9表达的变化情况。结果人骨髓间充质干细胞经过RA与Shh诱导后Nestin与Hb9的表达明显高于未加RA与Shh的对照组及空白组。结论 hBMSC具有向神经干细胞乃至运动神经元方向分化的潜能,RA与Shh可以在体外诱导hBMSC定向向该方向分化。     

肺结核病人肠道内的菌群变化分析

目的 研究肺结核病人肠道内的菌群变化。方法 入院后做便厌氧菌培养并计数。结果 肺结核病人肠道内的菌群发生紊乱,微生态平衡失调。初治组与正常组比较有显著性差异（P＜0．05）,复治组与正常组比较有非常显著性差异（P＜0．01）,初治组与复治组比较有显著性差异（P＜0．05）。结论 提示肺结核病人抗结核药物治疗的同时应调整肠道内的菌群,恢复微生态平衡,以提高机体的免疫功能,促进结核病变吸收。     

降解水稻秸秆的复合菌系及其微生物群落结构演替北大核心CSCD

【目的】比较和分析从堆肥中富集的水稻秸秆降解菌系F1和F2的纤维素分解能力、微生物群落结构及其在秸秆降解过程中的演替,从而探究微生物群落结构与秸秆降解效率的相关性。【方法】采用DNS(3,5-二硝基水杨酸,3,5-dinitrosalicylic acid)定糖法测定发酵液中的外切纤维素酶活;采用范氏(Van Soest)洗涤纤维分析法测定发酵前与发酵后的秸秆纤维素、半纤维素、木质素的含量,并计算降解率;采用16S r RNA基因序列分析和实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,Q-PCR)对秸秆降解过程中的微生物物种组成及特定的功能微生物进行定性和定量分析。【结果】复合菌系F1的水稻秸秆总降解率、纤维素降解率、半纤维素降解率显著高于复合菌系F2;2种复合菌系的外切纤维素酶活性与cel48基因的拷贝数变化趋势一致;复合菌系F1的物种较丰富,优势物种是好氧细菌,复合菌系F2的物种组成较单一,培养后期具有较高比例的厌氧纤维素分解菌;培养前4天,复合菌系F1和F2的优势物种均为Unclassified Bacillales和Bacillus;第4天之后,不同复合菌系的优势物种及丰度出现差异,F1的优势物种主要属于Bacteroidetes,F2的优势物种主要属于Firmicutes;虽然Petrimonas和Pusillimonas是培养后期的共有优势物种,但是Petrimonas在复合菌系F2中的相对丰度(38.30%)显著高于F1(9.47%),且培养第8天的F2中的Clostridiales OPB54增加至14.85%。【结论】cel48基因拷贝数变化与秸秆纤维素的降解效率、外切纤维素酶活性变化具有一定的相关性,cel48基因可作为潜在的生物分子标记监测秸秆纤维素的降解过程;微生物群落结构对秸秆纤维素的降解效率具有显著影响,Unclassified Bacillales,Bacillus,Petrimonas,Pusillimonas是复合菌系F1和F2降解秸秆纤维素过程中的重要物种。     

miR-194a介导饲料维生素D3调节黄颡鱼JAK-STAT免疫通路的研究

为了研究miRNA如何介导饲料维生素D3在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)JAK-STAT通路中调节免疫应答的机制,选择黄颡鱼幼鱼为主要研究对象,设计了3组维生素D₃浓度分别为1120、3950和16600 IU/kg的饲料,开展了为期12周养殖实验,养殖实验结束后进行鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)攻毒实验。对攻毒后的头肾和脾脏组织进行Illumina高通量测序,筛选差异表达的miRNAs,并对差异表达miRNAs进行靶基因的生物信息学预测和富集分析,发现miR-194a的靶基因富集在JAK-STAT信号通路中;进一步通过双荧光素酶报告基因实验验证了miR-194a对靶基因jak2a和tyk2具有靶向性调控的关系,能够发挥对jak2a和tyk2的抑制作用;通过体外巨噬细胞实验,在细胞中同样检测到miR-194a可以响应培养基中不同浓度的活性维生素D₃,并对靶基因jak2a与tyk2同样发挥抑制作用;通过进一步对靶基因在JAK-STAT通路中的下游基因表达检测,发现随着JAK-STAT信号通路...     

微生态制剂4联活菌片治疗肠结核引起的腹泻的疗效观察

观察４联活菌片治疗肠结核引起的腹泻效果。结果治疗２周后治疗组有效率为９４．１％,对照组有效率为２９．０％（Ｐ＜０．０１）。治疗前与治疗２周后肠道内菌群变化：治疗前治疗组与对照组比较无差异（Ｐ＜０．０５）,两组与正常比较有显著差异（Ｐ＜０．０１）。治疗组治疗前、后比较有显著差异（Ｐ＜０．０１）。对照组治疗前、后比较无显著差异（Ｐ＜０．０５）。治疗后治疗组与对照组比较有显著差异（Ｐ＜０．０１）。治疗后     

骨髓基质干细胞的诱导分化及其治疗癫痫的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞的方法及脑内移植治疗大鼠癫痫模型的作用。方法无菌条件下分离纯化BMSCs,用bFGF 10ng/ml、RA0.5μmol/L的DMEM/F12诱导72h后,部分用于免疫荧光检测nestin,其余的继续用bFGF 10ng/ml、RA 0.5μmol/L及神经营养因子NT-3 20ng/ml、BDNF 20ng/ml的DMEM/F12诱导4d,检测GAD67。皮下注射匹罗卡品建立癫痫大鼠模型,采用行为学分析筛选模型。通过立体定位仪,用微量注射器将BMSCs来源的神经干细胞和神经营养因子移植入癫痫鼠海马内,观察大鼠行为变化,存活2、4周后,心脏灌注取脑,冰冻切片免疫组化双标检测移植细胞的存活、迁移、分化情况。结果BMSCs诱导72h后,nestin表达阳性,4d后GAD67检测60%阳性。采用匹罗卡品造模,方法简便,但死亡率较高,仅15%-20%的动物造模成功。BMSCs源神经干细胞移植后可在海马内存活,向周围的脑区内迁移和整合。结论BMSCs源的神经干细胞在体外可诱导为γ-氨基丁酸能神经元并且对慢性癫痫有一定的治疗作用。