玫烟色棒束孢Pr1酶活力、Pr1酶基因表达量与其毒力的相关性

丝氨酸弹性凝乳蛋白酶Pr1是一类能高效降解昆虫体壁蛋白的重要酶,其活力与虫生真菌的毒力有很大的关系。探索玫烟色棒束孢不同菌株Pr1酶活力、Pr1蛋白酶基因表达量与毒力的相关性对该菌的应用具有重要的意义。文中采用专一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA和荧光定量PCR分别测定了玫烟色棒束孢不同菌株的Pr1酶活和Pr1基因的表达量,并采用坡塔喷雾法测定了供试菌株对桃蚜的毒力。结果表明:不同供试菌株Pr1蛋白酶活力与其毒力的线性回归方程为y=3.64x+0.62,R~2=0.432,两者呈正相关;供试菌株Pr1酶活力、Pr1基因表达量与毒力的回归方程为y=0.236+10.833x_1–0.039x_2 (x_1=Pr1酶活力,x_2=Pr1基因表达量),R~2=0.568,说明线性拟合方程能很好地反映原始数据;序列相关系数D-W为2.444,在0.05水平上相关显著,表明Pr1酶活力、Pr1基因表达量对毒力有显著影响;VIF=12.705表明Pr1酶活力、Pr1基因表达量存在中度多重共线性。因此建议将Pr1蛋白酶的酶活力和Pr1基因表达量作为菌株毒力筛选时的重要指标。     

绿豆象幼虫虫龄的划分及末龄幼虫头部形态和感器观察

【目的】明确绿豆象Callosobruchus chinensis幼虫的龄期,了解其末龄幼虫头部感受器的种类、形态和分布。【方法】测量绿豆象幼虫体长、头壳宽和上颚宽,根据所得数据的频次分布图、关系拟合结果和戴氏法则确定绿豆象最佳分龄指标,明确幼虫虫龄数,并利用Crosby生长法则和线性回归的方法进行验证;采用扫描电镜对末龄幼虫头部形态及感受器进行观察。【结果】绿豆象体长、头壳宽和上颚宽的频次分布均呈显著的4个峰,因此推断绿豆象幼虫为4个虫龄。各龄的体长变幅分别为1.581～2.556, 2.406～3.381, 3.381～4.281和4.206～4.881 mm,头壳宽度变幅分别为0.444～0.689, 0.654～0.934, 0.934～1.179和1.144～1.389 mm,上颚宽变幅分别为0.080～0.256, 0.234～0.344, 0.322～0.542和0.542～0.652 mm。体长、头壳宽和上颚宽均符合戴氏法则和Crosby生长法则,并呈现明显的线性关系,因此体长、头壳宽和上颚宽可作为绿豆象幼虫龄期划分的重要指标。头壳宽的Crosby指数均小于体长和上颚宽的Crosby指数,且头壳宽与体长测量值的对数值与幼虫龄期的相关系数要优于上颚宽测量值的对数值与幼虫龄期的相关系数,因此可将头壳宽作为最佳分龄指标。绿豆象末龄幼虫头部感器共有锥形感器、毛形感器、瓶形感器、刺形感器、板形感器、栓锥形感器和坛形感器7种感器,主要分布于触角、下颚须、上唇和上颚。【结论】绿豆象幼虫分龄形态指标和头部形态观察为研究其行为活动及综合防治提供理论基础。     

绿豆象气味结合蛋白基因的克隆及表达分析

【目的】对绿豆象Callosobruchus chinensis气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)基因进行克隆、鉴定和组织表达分析,为研究OBPs在绿豆象嗅觉感受过程中的功能奠定基础。【方法】基于绿豆象触角转录组数据,通过RT-PCR克隆绿豆象6个OBP基因并进行生物信息学分析;通过qRT-PCR分析OBP基因在绿豆象雌雄成虫头(不含触角)、触角、腹、足和翅各组织中的表达情况。【结果】获得了6个绿豆象OBP基因的开放阅读框,命名为CchiOBP1-CchiOBP6(GenBank登录号: MN832700-MN832703, MN901841-MN901842);CchiOBP5为一段C端不完整的Minus-C OBP,其余均属于完整的Classical OBPs,预测6个CchiOBPs均含有信号肽。系统发育分析表明CchiOBP1, CchiOBP2和CchiOBP5与叶甲科(Chrysomelidae)昆虫OBPs的亲缘关系较近,CchiOBP3, CchiOBP4和CchiOBP6与天牛科(Cerambycidae)昆虫OBPs的亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,6个CchiOBPs基因在绿豆象成虫的触角、头(不含触角)、腹、翅和足部均有不同的表达量,CchiOBP1-4和CchiOBP6在雌雄成虫触角中均呈现高表达,且极显著高于在其他组织中的。CchiOBP5在雌成虫触角和头部(不含触角)中呈现高表达,但在雄成虫中表现为在足部的表达量显著高于在其他组织中的,在触角中的表达量最低。【结论】确定了绿豆象6个CchiOBPs基因的核苷酸和氨基酸序列组成,其中有5个CchiOBPs基因在绿豆象雌雄成虫触角中高表达,推测其在绿豆象嗅觉识别寄主植物过程中发挥重要作用。     

菜青虫感染玫烟色拟青霉后血淋巴蛋白质含量及几种保护酶活力的变化

对玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus侵染3、4龄菜青虫Pieris rapae后,其血淋巴中蛋白质含量、体内保护酶及谷胱甘肽S-转移酶活力进行了研究。结果表明,感病的3、4龄菜青虫血淋巴中蛋白质含量明显低于同期未感染的幼虫;感病虫体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的活力发生了不同程度的改变,其中对3龄菜青虫体内酶活力的影响比4龄幼虫大。此外被侵染的3、4龄菜青虫体内谷胱甘肽S-转移酶活力在感病前期显著高于同期未感染的菜青虫,而在感病后期明显低于同期未感染的菜青虫。     

玫烟色棒束孢侵染对小菜蛾幼虫体内不同酶活的影响

在实验室条件下,测定了昆虫病原真菌玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea的侵染对小菜蛾Plutella xylostella3龄幼虫体内酚氧化酶(PO)和不同抗氧化酶类,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢(CAT)及谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活力的变化。结果表明,玫烟色棒束孢侵染小菜蛾3龄幼虫后,体内PO、SOD、POD、CAT和GSTs活力均受到明显的影响。其中感病小菜蛾幼虫体内的PO活力始终高于同期未感染的小菜蛾幼虫,当接菌40h时,酚氧化酶活力达到最大37.4U/g,为对照的2.6倍,而SOD、POD、CAT和GSTs活力在感病前期明显高于对照,接菌40–48h各种酶活力均达到最大,当接菌56h酶活力开始下降,64h时酶活力均明显低于对照。可见玫烟色棒束孢的侵染严重干扰了小菜蛾幼虫体内正常的生理活动。     

虫生真菌玫烟色棒束孢Pf9606抗逆性的研究

采用凹玻片悬滴法测定了玫烟色棒束孢在高温、紫外照射、紫外保护剂和杀菌剂等逆境胁迫下分生孢子的存活率。结果表明:玫烟色棒束孢Pf9606分生孢子在36～45 ℃高温下连续处理24 h后,该菌孢子几乎不能存活;36～45 ℃短时高温处理后,随温度的升高和处理时间的延长,孢子存活率明显降低;随紫外照射时间的延长,玫烟色棒束孢孢子存活率明显降低,当紫外照射50 s时,孢子存活率为55.33%,当照射时间延长为180 s时,孢子不能存活;不同浓度的抗坏血酸和高浓度的荧光素钠可提高玫烟色棒束孢抗紫外照射能力,抗坏血酸的理想浓度为0.2 mg/mL,荧光素钠的理想浓度为0.9 mg/mL,而不同浓度的刚果红和氧化锌对玫烟色棒束孢没有保护作用;玫烟色棒束孢与杀菌剂72%农用硫酸链霉素、70%代森联和58%甲霜灵锰锌混用后,对该菌孢子存活影响较小,不同浓度下孢子存活率均达85%以上,而常规浓度的氟吗·锰锌对玫烟色棒束孢孢子存活有较强的抑制作用。     

绿豆种质资源的ISSR遗传多样性分析

利用ISSR标记对33份绿豆种质进行了遗传差异和亲缘关系分析。 结果表明,从46条ISSR引物中筛选出10条扩增条带清晰、多态性高的引物,利用这10条引物从33份绿豆种质中共扩增出118条条带,其中多态性条带115条,多态性位点比例98.18%。遗传相似性与聚类分析结果表明,供试绿豆种质间的遗传相似系数范围为0.50～0.98之间,平均0.68。当遗传相似性系数为0.682时,供试33份绿豆种质资源分为4个ISSR类群( ISSR Groups,IGs),第Ⅰ类群包括产地为黑龙江、吉林共9份和河北的1份绿豆种质资源,第二类群包括河南、山西和陕西的所有和河北的4份绿豆种质资源,第三类群为来自泰国的5份绿豆抗虫资源,第四类群包括山东和内蒙各2份绿豆资源;当遗传相似系数为0.98时,供试的33份绿豆种质资源可被全部区分开。 ISSR分析结果表明, ISSR类群划分与绿豆的地理来源存在一定相关性;而同一类群中,地理来源相同的绿豆种质间也存在一定的遗传差异。     

两种表面活性剂对玫烟色棒束孢PF904菌株侵染小菜蛾幼虫的影响

【目的】在前期筛选试验的基础上,比较表面活性剂对玫烟色棒束孢Isaria fumosoroseus PF904菌株侵染小菜蛾Plutella xylostella 3龄幼虫的增效作用,获得可提高玫烟色棒束孢PF904防治效果的助剂。【方法】通过扫描电镜观察和室内致病力试验,测定喷施分别添加表面活性剂聚二甲基硅氧烷(OFX-0193)（终浓度125 mg/L）和二异丁基萘磺酸钠(Nekal)(终浓度250 mg/L）的玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液后玫烟色棒束孢PF904在小菜蛾3龄幼虫体表的孢子附着量及对小菜蛾3龄幼虫的侵染速率和致病力。【结果】添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193可显著提高玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液在小菜蛾3龄幼虫体表各结构区的孢子附着量,其中添加250 mg/L Nekal的玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液在小菜蛾3龄幼虫体表刺状突起结构区、平缓结构区和嵴状突起结构区的孢子附着量分别为对照(添加清水的孢子悬浮液)的2.19, 1.78和1.94倍,说明Nekal提高了玫烟色棒束孢PF904的孢子附着率;添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193均显著缩短了玫烟色棒束孢PF904孢子萌发时间,促进附着孢的形成,提高了玫烟色棒束孢PF904的侵染速率。室内致病力测定结果表明,玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液中添加250 mg/L Nekal和125 mg/L OFX-0193可显著提高玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液对小菜蛾3龄幼虫的致病力,其中添加250 mg/L Nekal的玫烟色棒束孢PF904孢子悬浮液对小菜蛾3龄幼虫的校正死亡率达79.2%,致死中时(LT₅₀)降低为2.71 d,说明Nekal的增效作用显著。【结论】250 mg/L Nekal为玫烟色棒束孢PF904的适宜的助剂和添加浓度,可显著提高其对小菜蛾幼虫的防治效果。     

蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响,采用室内人工接虫和生化测定的方法,研究了在离体条件和饲喂条件下4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶的抑制作用,并测定了绿豆象幼虫取食不同含量的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的人工绿豆后,其中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的变化.结果表明:在离体条件下,供试4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有明显的抑制作用,且浓度越大,抑制效果越显著,其中以20μg·mL^-1的MBTI对3种酶活性的抑制效果最强,3种酶活性分别比对照降低了62.5%、41.2%和38.7%,而卵粘蛋白抑制剂(OI)抑制效果最弱.绿豆象幼虫取食含不同抑制剂的人工绿豆后,中肠内3种酶活性也均受到一定的抑制作用,取食后随龄期的延长,3种酶活性有所升高但仍显著低于对照,且以MBTI的抑制作用最强.当绿豆象幼虫取食不同含量MBTI的人工绿豆后,随MBTI含量的增加,对总蛋白酶活性和类胰蛋白酶活性的抑制作用均逐渐增强,但对类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用并不显著,只有当MBTI含量达20%时,对类胰凝乳蛋白酶活性才表现出明显的抑制作用.     

抗、感绿豆象绿豆种子差异蛋白的分离与鉴定

为寻找抗绿豆象绿豆种子中的重要抗虫成分,以抗虫绿豆晋绿7号、B20及感虫绿豆潍绿2117为试验材料,采用蛋白质双向电泳(2-DE)和质谱技术,对抗、感虫绿豆中差异蛋白及功能进行了鉴定与分析。结果表明,抗、感虫绿豆中差异蛋白表达量超过2.5倍的点共有15个。其中6个蛋白点通过数据库得到了成功鉴定,涉及3种蛋白质,分别为8S球蛋白(α亚型和β亚型)、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBis CO)亚基结合蛋白和合成淀粉酶与胰蛋白酶两种抑制剂的前体多肽链。蛋白点B49(即8S球蛋白α亚型)和B31(RuBis CO亚基结合蛋白)在抗、感虫绿豆中的差异表达量分别达到10 000倍和23倍。抗虫绿豆中8S球蛋白α亚型及β亚型、RuBis CO伴侣蛋白及胰蛋白酶抑制剂的前体作为抗虫物质影响了绿豆象的生长发育甚至导致其死亡,与抗虫性的量效关系及联合效应还需进一步验证。