细菌双杂交系统的改进

解析蛋白质之间的相互作用,对理解调控和代谢等生物学过程具有重要意义。其中基于互补腺苷酸环化酶功能的细菌双杂交系统是一种研究蛋白质之间相互作用的有效手段。本文在利用该系统时发现存在假阳性高的缺陷。进一步报告基因活性分析表明产生假阳性的原因是不同克隆的生理状态影响了LacZ的输出,即lacZ启动子除了受cAMP信号分子的控制,还受到其他调控蛋白的直接或间接的调控。为了降低生理因素对报告基因的影响,我们向该系统引入用多拷贝lacZ启动子控制的gfp报告基因。这不仅通过增加lacZ启动子的数量,弱化了生理因素的影响;还实现了第二个报告基因gfp与lacZ同时报告蛋白质之间的相互作用情况,提高了输出的准确性。系统的实验验证表明,我们改进的细菌双杂交系统的灵敏性确实得到大幅提高。     

转录调控研究的方法学进展

基因的表达在多个层次受到严格的控制,其中转录水平的调控是控制基因表达的重要环节之一。近几年,随着分子生物学研究方法的不断发展,转录调控的研究方法学也出现了新的变化。本文综述了基于作者所在课题组对链霉菌次级代谢调控研究过程中优化和改进的转录调控研究方法,如基于SYBR Gold的凝胶阻滞实验,基于荧光标记和毛细管电泳检测的足迹法,基于报告基因的直接调控关系分析等;同时也对研究调控蛋白和靶启动子相互作用的新方法进行了阐述,如表面等离子共振技术和等温滴定量热测定技术等。这些转录调控研究方法的优化和总结,能够帮助研究者开展相关研究。