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猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性   总被引:2,自引:0,他引:2  
从黑龙江省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以RT-PCR法扩增出猪流行性腹泻病毒M基因后,采用细胞培养法进行病毒分离。对细胞培养分离物进行间接免疫荧光、免疫电镜观察、RT-PCR及ELISA法检验,其中间接免疫荧光试验可见培养细胞中存在明显的特异性绿色荧光;免疫电镜下可见大小符合预期、有囊膜、花瓣状的典型冠状病毒结构特征;RT-PCR检测证实存在PEDVM基因;间接ELISA检测中平均P/N比值为7.6;从而确认为分离到一株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),命名为PEDVLJB/03株。随后,对该分离毒株的培养特性及如何提高病毒滴度进行探索。通过摸索该分离毒株的蚀斑形成条件,建立了PEDV蚀斑形成方法,并采用该方法进行病毒的蚀斑纯化,纯化得到PEDV大蚀斑克隆株和小蚀斑克隆株。对大、小两种蚀斑克隆株的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑克隆株细胞感染滴度相差明显。  相似文献   
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重组猪乳铁蛋白N端的高效表达及抑菌活性检测   总被引:1,自引:0,他引:1  
为获得表达猪乳铁蛋白基因的重组菌株,并检测其表达的重组猪乳铁蛋白抑菌活性,应用RT-PCR方法从泌乳3d后母猪乳腺组织中扩增了猪乳铁蛋白N端1077bp的PLF-N基因片段,与GenBank上发表的4株猪乳铁蛋白基因序列相比,核苷酸同源性均达到99%以上。为了得到高表达量的PLF-N基因,以扩增的PLF-N片段为参考模板,经过密码子优化,全基因合成了编码猪乳铁蛋白N端的基因PLF-NS。将其定向插入到原核表达载体pET-30b中,转化大肠杆菌BL21,获得了表达PLF-NS的重组菌pET-PLF-NS/BL21;经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,以及通过SDS-PAGE和Western blotting分析均表明猪乳铁蛋白得到了正确表达,其产物分子量约为42kDa,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的32%,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经裂解、纯化、复性处理后纯度达到98%。用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明重组猪乳铁蛋白具有明显的抑菌作用。表明通过基因优化对表达量低的基因进行改造使之高效表达,是一种提高表达效率的有效手段。  相似文献   
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