细胞自噬与炭疽致死毒素的相互作用

目的：研究炭疽致死毒素在巨噬细胞中引起细胞自噬现象以及细胞自噬对炭疽致死毒素毒性的影响。方法：采用电子显微镜观察、单丹磺酰尸胺（MDC）荧光染色、Western印迹检测研究炭疽致死毒素作用后的巨噬细胞;采用MTT法检测细胞自噬对炭疽致死毒素毒性的影响。结果：采用以上3种方法,在巨噬细胞J774A.1中均可检测到细胞自噬现象;通过诱导或抑制细胞自噬,分别提高或降低了炭疽致死毒素的半数致死浓度。结论：炭疽致死毒素在巨噬细胞内能引起细胞自噬现象;细胞自噬能减弱炭疽致死毒素对巨噬细胞的毒性。     

布鲁菌104M∶Omp19过表达株的构建与免疫保护性评价

目的:利用表达载体p NSGro E2His构建104M∶Omp19过表达株,以增强现有布鲁菌疫苗104M株免疫保护效果。方法:以布鲁菌疫苗104M株基因组为模板,通过PCR扩增得到Omp19基因;将经过Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切的Omp19基因连接到经同样双酶切处理的p NSGro E2His载体上,构建Omp19-p NSGro E2His过表达质粒;将构建的过表达质粒转化布鲁菌104M株感受态细胞,利用氯霉素抗性筛选构建成功的104M∶Omp19过表达株;通过皮下免疫BALB/c小鼠,从激发的抗体水平、细胞因子水平以及对抗布鲁菌A19株攻毒后的保护作用等方面评价104M∶Omp19过表达株的免疫保护效力。结果:PCR及Western印迹验证表明获得了104M∶Omp19过表达突变株;免疫评价实验显示104M∶Omp19在抗体水平、细胞因子水平与攻毒保护性方面均优于104M,低剂量免疫即可达到较好的保护效果。结论:布鲁菌疫苗104M株过表达Omp19抗原后,免疫保护效果显著增强,可作为一种新的布鲁菌疫苗候选菌株进行后续研究。     

乙型肝炎病毒核心蛋白作为表位疫苗载体的应用

乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B viruscore protein,HBc)可以形成二十面体对称的颗粒样结构,由于其N端、C端和主要免疫显性区域(Major immunodominant region,MIR)允许一定程度的缺失和外源插入,并且能够将外源序列重复且高密度地暴露在颗粒的表面,诱发强烈的外源序列特异的体液和细胞免疫反应,从上世纪80年代中期就开始被运用于表位疫苗的研究。以下主要从影响HBc作为表位疫苗载体的因素,包括HBc长度、外源插入位点和表位序列的性质等来介绍HBc作为表位疫苗载体的应用。     

结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白ESAT-6增强巨噬细胞吞噬功能

【目的】研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)分泌蛋白ESAT-6(early secreted antigenictarget of 6 kDa)对巨噬细胞吞噬功能的影响。【方法】用重组质粒pFLAG-ESAT-6和pFLAG-EGFP转染RAW264.7细胞,经G418筛选,PCR、RT-PCR和Western blot鉴定,获得稳定表达flag-ESAT-6和flag-EGFP的RAW细胞系,然后用流式细胞术观察各稳转细胞系吞噬荧光微球的能力,并用共聚焦显微镜和菌落计数法检测稳转细胞系吞噬大肠杆菌(Escherichia coli)的能力。【结果】获得了稳定表达flag-ESAT-6的RAW-E6细胞系和表达flag-EGFP的RAW-EGFP细胞系;流式细胞术检测结果表明RAW-E6吞噬荧光微球的能力显著强于野生型细胞系RAW264.7和对照细胞系RAW-EGFP;菌落计数和激光共聚焦分析表明RAW-E6细胞系吞噬E.coli的能力也显著强于RAW264.7和RAW-EGFP。【结论】通过胞内表达发现结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6能够增强巨噬细胞的吞噬功能,这将为深入理解结核分枝杆菌的致病机制提供新的思路。     

稳定表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的RAW264.7细胞系的建立

为研究结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis分泌蛋白ESAT-6 (Early secreted antigenic target of 6 kDa) 对巨噬细胞相关功能的影响,将正确构建的重组质粒pEGFP-C1-ESAT-6和空载体pEGFP-C1以脂质体介导的方法转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中,经过G418筛选后建立稳定表达EGFP-ESAT6融合蛋白以及EGFP的细胞系,并通过RT-PCR、荧光显微镜及Western blotting方法,在基因和蛋白两个水平对所建立的稳转细胞系进行鉴定。结果证实EGFP-ESAT6融合基因成功整合入RAW264.7细胞基因组并能够稳定表达,为后续的ESAT-6调控巨噬细胞机理研究提供了平台。     

结核分枝杆菌分泌蛋白EspB 在RAW264.7细胞中的稳定表达

[目的]建立能够稳定表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白EspB(Rv3881c)的RAW264.7细胞系,为研究EspB蛋白在调控巨噬细胞功能中所起的作用提供科学依据.[方法]首先成功构建的重组质粒pEGFP-C1-EspB,然后将重组载体pEGFP-C1-EspB和空载体pEGFP-C1以脂质体介导的方法转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中,经过G418筛选后建立稳定表达EGFP-EspB融合蛋白以及EGFP的细胞系,并通过RT-PCR、荧光显微镜及Western blot方法,在基因和蛋白两个水平对所建立的稳转细胞系进行鉴定.[结果]EGFP-ESAT6融合基因成功整合入RAW264.7细胞基因组并能够稳定表达,成功获得了能够稳定表达EGFP-EspB融合蛋白以及EGFP的细胞系.[结论]本试验利用脂质体介导的方法,将构建的重组载体pEGFP-C1-EspB和空载体pEGFP-C1转染至Raw264.7细胞系中,获得了稳定表达EGFP-EspB融合蛋白的巨噬细胞系,为阐明EspB分泌蛋白在调控巨噬细胞功能中所起的作用以及EspB与巨噬细胞蛋白之间的相互作用提供了研究平台.     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达及膜定位研究

从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因,克隆入pET21a(+)载体.将成功构建的pET21a(+)-ESAT-6重组质粒转化入感受态BL21(DE3)中,经诱导表达后,使用SDS.PAGE和Western blot鉴定.超声破碎后发现目的蛋白以可溶性表达形式存在,经过Ni-NTA柱和DEAE-Seph...