泡桐丛枝植原体tRNA异戊烯基焦磷酸转移酶基因克隆、原核表达及功能分析

【目的】为了鉴定植原体tRNA异戊烯基焦磷酸转移酶基因(tRNA-ipt)的表达及蛋白功能,探索植原体致病机理。【方法】对泡桐丛枝、桑萎缩、长春花绿变及苦楝丛枝植原体tRNA-ipt基因完整序列进行PCR扩增和生物信息学分析。对泡桐丛枝植原体tRNA-ipt基因进行原核表达并制备抗体。利用Western blot和FITC间接免疫荧光显微镜检测其在植原体中的表达。使用分光光度计分析该基因对大肠杆菌生长的影响,用ELISA测定转化菌株细胞分裂素含量。【结果】首次发现泡桐丛枝、桑萎缩、长春花绿变及苦楝丛枝植原体中完整tRNA-ipt基因,大小为876 bp,编码291个氨基酸,且N端均含有ATP/GTP结合位点保守序列(GPTASGKT)。4种植原体tRNA-IPT之间的氨基酸序列相似率为99.1%-99.5%,与同组植原体同源性在95.4%-99.3%,与其他组植原体同源性低于70%。SDS-PAGE结果显示tRNA-IPT蛋白在大肠杆菌中得到表达。首次获得泡桐丛枝植原体tRNA-IPT抗体并检测到该蛋白在泡桐发病组织中的特异表达。经过对转化菌株生长曲线及玉米素含量的测定,发现该基因能促进大肠杆菌后期生长和玉米素核苷的积累。【结论】4种植原体tRNA-ipt基因编码相同特性的功能蛋白,泡桐丛枝植原体tRNA-IPT蛋白能够在植原体中表达,根据该基因对异源菌株生长速率和激素合成的影响推断该蛋白可能参与植原体的细胞分裂素合成,在致病过程中起到重要作用。     

泡桐丛枝和枣疯病植原体tuf基因上游序列结构、功能和遗传变异比较分析

【目的】探究泡桐丛枝和枣疯病植原体tuf基因上游序列结构、功能差异及其遗传多样性。【方法】利用热不对称交错式PCR(TAIL-PCR)扩增枣疯病植原体tuf基因上游未知序列,利用启动子探针载体pSUPV4构建了泡桐丛枝和枣疯病植原体tuf基因上游序列的大肠杆菌异源表达体系,分析泡桐丛枝、苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、长春花绿变等16SrI组和枣疯病、樱桃致死黄化、重阳木丛枝等16SrV组株系tuf基因上游调控序列的遗传变异特征和启动子活性。【结果】泡桐丛枝等16SrI组植原体株系tuf基因和其上游fus A基因之间的间区序列长129-130 bp,预测有完整的启动子保守结构。泡桐丛枝植原体tuf基因上游130 bp片段具有启动子活性,此间区序列在5种35株16SrI组株系中存在4种变异类型;枣疯病植原体等16SrV组株系fusA和tuf基因间区长53-54 bp,未预测到完整启动子结构。枣疯病植原体tuf基因上游144 bp和346 bp片段均未检测到启动子活性,fus A和tuf基因间区序列在3种20株16SrV组株系中存在2种变异类型。fus A-tuf基因间区序列相对保守,基于此序列构建的进化树可清晰区分不同组别的植原体株系。【结论】研究方法和结果为深入研究植原体基因表达与调控、揭示植原体生长繁殖规律及其致病机理等奠定了良好的基础。     

植原体遗传多样性研究现状与展望

植原体是引起众多植物病害的一类重要的无细胞壁的原核致病菌, 其寄主种类多、危害面积广, 对经济、环境等影响严重。大量研究表明植原体存在丰富的遗传多样性。本文就植原体遗传多样性研究现状作一概要评述, 并对植原体遗传变异的研究技术、产生机制、与致病性关系等今后可能的研究方向作一展望。对已完成的5个植原体全基因组序列分析发现, 它们在大小、结构和功能等方面皆存在显著差异, 缺少很多标准代谢所需的基因。不同植原体中质粒的数量、大小和功能等也存在一定差异。植原体含有2个核糖体RNA编码基因, 其序列在不同株系中的变异奠定了现今植原体分类鉴定的基础。对植原体蛋白编码基因如核糖体蛋白编码基因(rp)、蛋白延伸因子基因(tuf、fusA)、转运蛋白基因(secY、secA)、效应子及非编码区序列如启动子、假基因等的深入研究可进一步揭示植原体更丰富的遗传变异特征。由于植原体分离培养困难, 人们对其形态特征、生理代谢等了解甚少, 因而全基因组测序、多位点序列分析等现代分子生物学技术将会成为植原体遗传变异研究的主要手段。植原体遗传多样性研究进展有助于从分子水平上系统地阐明植原体遗传变异规律、系统进化特征及其与寄主(植物和昆虫)、生态环境间的互作和适应关系, 并产生新的认识。这对于提高植原体的分类鉴定、致病机制、流行预测及病害防治等研究水平具有重要的作用和意义。     

植原体tuf基因与其上游部分基因结构和相关基因启动子保守区域特征及活性分析

植原体寄主种类多, 危害范围广, 开展其遗传多样性、关键基因调控等方面研究有助于提高该病害综合防治水平。通过长片段PCR引物扩增我国PaWB-sdyz、PaWB-fjfz和LY-fjya1植原体株系tuf基因及其上游6个基因的片段, 进行植原体基因启动子保守区域序列特征和多位点序列分析。利用启动子探针载体pSUPV4检测植原体tuf基因上游序列的启动子活性。扩增获得PaWB-sdyz、PaWB-fjfz、LY-fjya1株系tuf基因上游12,745-12,748 bp序列, 比较分析发现PaWB-sdyz、PaWB-fjfz、LY-fjya1、OY-M、AYWB、PAa、SLY、AT植原体株系tuf与其上游6个基因的结构顺序皆为5’-rplL-rpoB-rpoC-rps12-rps7-fusA-tuf-3’。推测出可能的植原体启动子保守区域模式序列: T₉₀T₁₀₀G₉₂T₇₅G₆₇A₈₅ (-35区); T₉₀A₉₆T₉₂A₉₈T₇₃T₉₀ (-10区)。基于8个植原体株系的rplL-tuf核苷酸序列编码基因、非编码序列、氨基酸序列的多位点序列分析可将不同植原体株系以较高的支持率清晰地区分, 不同植原体株系rplL-tuf核苷酸非编码区变异水平更高。16SrI组植原体tuf基因上游序列存在3种变异类型, 其代表株系PaWB-fjfz、LY-fjya1 tuf基因上游130 bp片段和CWB-hnsy1 tuf基因上游129 bp片段皆具有启动子活性。     

苦楝丛枝植原体质粒的测定与分子特征

摘要: 【目的】测定苦楝丛枝植原体(CWB 植原体)质粒并分析其分子特征。【方法】扩增苦楝丛枝植原体质粒片段并进行系统进化分析,预测质粒编码蛋白的跨膜区、亚细胞定位;以质粒pCWBFq repA为模板制备探针,利用Southern blot 方法检测苦楝丛枝植原体及其他几种植原体的质粒。【结果】测定了苦楝丛枝植原体福清株系的一个质粒pCWBFq,该质粒全长4446 bp,A + T含量为73.5%,编码6个蛋白,其中pCWBFq P2-P5 五个编码蛋白分别含有3、2、1 和2个跨膜区,其信号肽(Singnal Peptide,SP)信号值分别为0.989、0.505、0.918和0.914。氨基酸序列相似性比较表明: pCWBFq RepA 蛋白与其他植原体质粒RepA 的同源性在9.6%－85.6%之间,而pCWBFq SSB 蛋白与其他植原体质粒SSB 的同源性在74.0%－89.4%之间。用pCWBFq repA 探针检测到苦楝丛枝植原体中质粒的存在,同时也能够检测到16SrI组的泡桐丛枝植原体(PaWBNy),海南长春花绿变植原体(PeVHn),苦楝丛枝植原体福州株系(CWBFz)和桑树萎缩植原体濮阳株系(MDPy)中的质粒,但16SrV 组的枣疯植原体北京株系(JWBBj)、樱桃致死黄化西昌株系(CLYXc)和重阳 木丛枝南昌株系(BiWBNc) 中未能检测到任何杂交信号。【结论】苦楝丛枝植原体质粒pCWBFq编码的6个蛋白中,除与质粒复制有关的RepA和SSB外,另外4个均为含有疏水结构的分泌蛋白或膜蛋白。植原体质粒的同源基因间存在程度不同的变异,其中repA 基因在所有植原体质粒上均存在,但变异性相对较大,而ssb基因仅存在于16SrI 组植原体质粒中,且变异相对较小。16SrI 组的CWBFq、PaWBNy、PeVHn、CWBFz和MDPy 中均存在数量和大小不同的质粒,而16SrV 组的JWBBj、CLYXc和BiWBNc 中或含有的质粒因与pCWBFq repA 探针的同源性较低而不能被检测到。