融合表达氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE合成L-别异亮氨酸

【背景】L-异亮氨酸(L-isoleucine,L-Ile)和L-别异亮氨酸(L-allo-isoleucine,L-allo-Ile)是自然界中广泛存在的一对同分异构体。抗感染抗生素Desotamides结构中含L-别异亮氨酸结构单元,其生物合成途径中的氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE可以协作催化L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸相互转化。【目的】通过理性设计,使氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE融合表达,研究融合蛋白DsaDE催化异亮氨酸和别异亮氨酸相互转化的功能。【方法】利用PCR分别扩增dsaE基因编码区DNA片段、以及含dsaD基因编码区和114个碱基接头序列的DNA片段dsaD-linker,利用酶切位点KpnI将dsaE和dsaD-linker相连,形成das DE重组序列,并克隆至pET28a(+)中,将重组质粒pET28a-dsaDE转化至Escherichia coli BL21(DE3)中进行融合表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白DsaDE;分别以L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸为底物进行融合蛋白的体外酶活性检测,利用高效液相色谱对酶反应产物进行分析。【结果】PCR验证、酶切验证以及测序结果证明pET28a-dsaDE重组载体具有正确序列;N-末端和C-末端融合6个组氨酸标签的融合蛋白DsaDE在E. coli BL21(DE3)中获得可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析法一步纯化获得纯度约95%的融合蛋白,纯化的融合蛋白DsaDE具有较好的活性,能够催化L-isoleucine和L-allo-isoleucine间的相互转化。【结论】氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE成功融合表达,经一步Ni-NTA亲和层析法纯化即可获得纯度较高的融合蛋白,融合蛋白同时具有氨基转移酶和异构酶的活性,为进一步研究L-别异亮氨酸的工业化生产奠定了基础。     

Marinacarbolines甲基化基因mcbD的筛选及其功能

【目的】定位Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组中负责marinacarbolines甲基化修饰的基因mcbD并鉴定其功能。【方法】游离M.thermotolerans SCSIO 00652的基因组序列中功能注释为甲基转移酶的蛋白,使用MEGA 6自带的ClustalW与来自于marformycins生物合成途径中的Mfn G(D/L-酪氨酸甲基化酶)进行多序列比对,用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树,筛选到与MfnG进化关系最近的Orf03255(Mcb D);扩增mcbD后克隆至pET28a(+)并在E.coli BL21(DE3)中表达,结合Ni-NTA亲和层析法纯化获取较高纯度的McbD活性蛋白;以marinacarboline B为底物,利用高效液相色谱检测McbD的体外酶活;利用基于PCR-targeting的遗传操作体系构建mcb D插入失活突变株((35)mcbD)并分析其与野生型菌株的发酵产物差异。【结果】N-末端融合组氨酸标签的McbD蛋白在E.coli BL21(DE3)中可溶性表达,亲和层析纯化的McbD能够以marinacarboline B为底物催化形成marinacarboline C;mcbD基因阻断突变株ΔmcbD与野生型相比不产生化合物marinacarboline C,同时累积marinacarboline B。【结论】McbD为marinacarbolines生物合成中必需的O-甲基转移酶。     

羊肚菌营养方式的稳定碳同位素研究

采用稳定碳同位素分析方法对羊肚菌的营养方式进行了研究.发现山西省关帝山庞泉沟自然保护区羊肚菌生境中的δ13C=-24‰为菌根营养型/腐生营养型分界线;菌盖呈黑色、有纵脉的羊肚菌为腐生营养型,菌盖呈污黄色的羊肚菌为菌根菌营养型;云南、四川、北京等地羊肚菌的营养方式呈现相似规律.     

野生黄芩内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选

从野生黄芩的根、茎、叶中分离出97株内生真菌, 其中33株来自生长期植株, 64株来自成熟期植株。经分类鉴定, 隶属于38个属, 优势属为Alternaria, 成熟期的属种多样性高于生长期。将其中的95株内生真菌对14种指示菌进行抑菌试验, 发现其中91株内生真菌对一种或多种指示菌具有抑菌活性, 占分离菌株总数的95.8%。野生黄芩内生真菌对大肠杆菌CGMCC1.1103、枯草芽孢杆菌CGMCC1.769、蜡样芽孢杆菌ATCC1361、致病性大肠埃希氏菌ATCC49105、白色假丝酵母ATCC10231、小孢拟盘多毛孢CNUMB2PM01等6个指示菌菌株抑菌效果较好; 对单核细胞增生李斯特菌ATCC27708、普通变形杆菌ATCC33420、肠炎沙门氏菌ATCC14208、副溶血型弧菌ATCC27519、宋内氏痢疾杆菌ATCC51060、九州镰孢霉CNUMB2FK01等6个指示菌菌株抑菌效果较差; 对深红酵母CGMCC2.282和金黄色葡萄球菌ATCC12600没有抑制作用。     

真菌多糖水提及化学辅助提取方法研究进展

真菌多糖具有抗肿瘤、抗衰老、免疫调节等多种功效, 有较高的食、药用和商业价值。本文通过对实例的总结, 介绍热水浸提法、稀酸提取法、碱提取法、酶消化提取法等真菌多糖提取技术。通过比较阐述其优缺点、影响因素和适用范围, 为类似试验提供建议。