O型口蹄疫病毒VPl基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板,用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1.转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39 kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性.小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组.     

猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立

采用PCR方法从携带猪瘟病毒兔化弱毒(Hog cholera lapinized virus,HCLV)全长基因组cDNA的质粒pPOHCLV中扩增到长度为2000bp左右NS3基因序列,并将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建成重组原核表达载体pETNS3。将pETNS3在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行优化表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NS3主要以包涵体形式表达,分子大小约95kD。Western Blotting分析表明重组蛋白NS3具有免疫原性。采用Ni+亲和层析方法纯化得到重组蛋白NS3(90%)。以纯化的重组蛋白NS3为抗原初步建立了检测CSFVNS3抗体的间接ELISA方法,检测221份不同猪群和年龄猪的血清样品。检测结果与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果进行对比,阳性符合率为83.33%,阴性符合率为89.38%,总符合率为86.43%。30份存在差异的血清样品用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)进行检测,结果显示IFA检测结果与NS3间接ELISA和IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒符合率分别为56.67%和43.33%。     

O型口蹄疫病毒VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB 基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1。转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组。     

鹌鹑和三黄鸡IFN-α cDNA的克隆及序列分析

根据GenBank已登录的鸡和鹌鹑IFN-α基因序列,用Oligo6.0设计一对能同时扩增鸡和鹌鹑INF-α基因的共用引物,利用RT-PCR方法从经ConA诱导培养的三黄鸡、鹌鹑外周血淋巴细胞中分别扩增到IFN-αORF全长cDNA,并克隆到pET-28a( )载体上。将测序结果分别与GenBank中已收录的家禽类IFN-α核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果发现鸡、鹌鹑IFN-αcDNA遗传进化稳定,与GenBank中收录的鸡、鹌鹑IFN-α核苷酸序列同源性为98.6%~99.8%、99.8%。鸡与其它家禽类的IFN-α核苷酸序列比较分析发现,与鹌鹑亲缘性较高,同源性达86.9%~87.1%,但与家水禽(鸭、鹅)差距较大,同源性最高也只有67.6%;鹌鹑IFN-α核苷酸序列与家水禽同源性在也只在62.7%~62.9%之间;基因遗传进化树分析可见家禽类IFN-α被分成两个大分枝,分别是由鸡和鹌鹑两个小分支组成的一个大分支与家水禽独立分支组成。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病RT-PCR快速鉴别诊断方法的建立与临床应用

根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因的缺失信息,设计了3条特异性引物,以含高致病性PRRSV Nsp2基因的质粒pMDNSP2及普通PRRSV VR2332株RNA为模板,建立了快速诊断高致病性PRRSV RT-PCR方法.通过对临床组织病料的总RNA进行不同稀释倍数检测,结果表明该方法能从0.265 pg的总RNA中检测到PRRSV的基因,说明敏感性高.用该方法对猪瘟病毒(CSFV)、Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、伪狂犬病病毒(PRV),链球菌(Streptococcus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和大肠杆菌(Escherichia coli)同条件检测,结果都为阴性.进一步对36份疑似高致病性PRRSV临床组织病料细胞培养物、2株PRRSV商品活疫苗以及52个猪场所送检的184份临床样品进行了检测应用,结果36份疑似高致病性PRRSV临床组织病料的细胞培养物有5份样品为阳性且都为高致病性PRRSV,2株PRRSV商品活疫苗为普通PRRSV,52个猪场中有42个猪场(123份样品)呈阳性,其中只有1份为普通PRRSV.实验表明该方法能够准确地鉴别诊断高致病性PRRSV和普通PRRSV,且具有快速,敏感和特异的特点,具有临床实用性.