基于MTT染色法对葡萄生单轴霉孢子囊存活力的检测

本文利用MTT染色法和点接生物测定法对不同温度干燥处理36h后的葡萄生单轴霉孢子囊存活力和致病力进行了检测,并应用单因素试验和正交试验对其孢子囊进行了MTT染色条件的优化。结果表明：葡萄生单轴霉孢子囊MTT染色的最佳条件为温度36℃、MTT浓度 0.05%、染色48h,孢子囊染色率可达83.0%。20℃恒温干燥处理36h显著提高了孢子囊存活力,葡萄生单轴霉孢子囊的蓝色染色率为79.3%,叶片点接发病率为98.9%,显著高于对照的蓝色染色率52.0%和发病率62.7%。MTT染色得到的孢子囊蓝色染色率与点接生物测定法得出的发病率存在很好的线性关系y=1.276 1x-1.939 1,R²=0.996 1,孢子囊的蓝色染色率与叶片点接发病率呈正相关。本研究表明MTT染色法可以用于葡萄生单轴霉孢子囊存活力的快速和准确检测。     

葡萄生轴霜霉菌孢子囊的长期保存

为了解决葡萄生轴霜霉菌的活体保存问题,本文开展了多种保藏方法的研究。采用二甲基亚砜和甘油分别于不同低温条件下对孢子囊进行了保存,取出后进行接种试验。结果表明,孢子囊用不同保护剂处理后保存于-76℃中5d,10%二甲基亚砜处理的孢子囊经接种后发病面积百分率为68.3%,其致病性明显强于25%甘油处理;孢子囊用不同浓度的二甲基亚砜保存于-76℃中30d,5%和10%二甲基亚砜处理后致病性差异不显著,但明显高于15%、20%、25%二甲基亚砜处理的孢子囊;5%和10%二甲基亚砜处理的孢子囊,在-76℃中保存5d和15d后,致病性明显高于-20℃的处理;孢子囊经-76℃保存240d后,10%二甲基亚砜处理的孢子囊无致病性,而5%二甲基亚砜处理的发病面积百分率为56.3%,与对照无显著差异,说明孢子囊用含5%的二甲基亚砜处理能在-76℃中长期保存。     

内生枯草芽孢杆菌JL4在葡萄叶上的定殖及其对葡萄霜霉病的防治

为了明确枯草芽孢杆菌JL4在葡萄叶表面和内部的定殖情况,研究定殖与防治效果的关系,采用电击转化的方法将含有GFP基因的质粒pGFP78导入枯草芽孢杆菌JL4中,并得到成功表达GFP 的生防菌JL4-gfp,测试了标记菌株的稳定性及其对葡萄霜霉病菌的抑制作用.采用叶片喷雾法接种,用抗生素平板稀释分离回收,检测生防菌JL4-gfp在葡萄叶片的定殖情况,并将采回的叶片在室内接种葡萄霜霉菌孢子囊悬浮液进行生防测定.结果表明: 标记菌株在经过10次传代培养后,仍具有良好的发光表型,能稳定表达GFP蛋白,并且标记菌株JL4-gfp对葡萄霜霉菌保持了原有的抑菌作用;用抗生素平板稀释分离回收,检测到JL4-gfp菌株在葡萄叶片表面的定殖量在接种后的0、3和7 d分别为3.6×10⁵、2.7×10⁵和3.1×10³ CFU·g^-1;叶片内部的定殖在接种3 d后达到最大(9.6×10⁴ CFU·g^-1),然后下降,14 d后已经检测不到接种菌株;室内生防测定结果显示,喷雾后3 d对葡萄霜霉病的防治效果达88.0%以上,但7 d后则无明显防效.JL4-gfp的定殖量与其防治葡萄霜霉病的效果呈正相关,其有效定殖量临界值为10⁵ CFU·g^-1.     

BOX-PCR技术在微生物多样性研究中的应用

近年来在微生物多样性研究中,利用微生物基因组中广泛分布的短重复序列设计引物,选择性地扩增重复序列之间的不同基因区域,以得到大小不等的DNA扩增片段的方法日渐增多.以BOX插入因子(细菌基因组重复序列)为基础的PCR技术,具有操作简单快捷,可重复性强,容易获得较为丰富的扩增条带等特点,最初主要应用于细菌的多样性研究.目前研究发现用BoxA1R引物对微生物中的真菌、放线菌进行选择性的扩增,也能够达到很好的遗传及多样性分析的目的.本文综述了BOX-PCR指纹图谱分析技术的特点和一般步骤;结合作者对植物内生细菌的BOX-PCR指纹图谱分析体系的优化,对BOX-PCR技术的改进进行了总结:并对该技术在微生物菌株多样性研究领域的应用现状和前景进行了阐述.