假单胞菌DLL-E4尿黑酸降解基因的克隆与功能的初步分析

通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变子中筛选到1株在LB培养基上积累红褐色物质的突变株M18,该突变株不能以L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, Phe)为唯一碳源生长。SEFA-PCR扩增转座子侧翼序列发现其与已报道的尿黑酸1,2-双加氧酶基因hmgA的同源性为92%。将hmgA定向克隆至表达载体pET-29a中,转化至Escherichia coli BL21,经IPTG诱导后可表达分子量约为48kD的蛋白;诱导后转化子粗酶液对尿黑酸有很好的降解效果。将hmgA连入自杀性载体pEX19Gm,通过同源重组整合至M18染色体中,使其恢复了DLL-E4利用Phe的能力,证实了HmgA是尿黑酸苯环裂解酶。     

长效促胰岛素降糖酵母的构建及其对糖尿病模型小鼠的治疗效果

益生菌生物药物是指通过口服表达药用多肽(蛋白)的重组益生菌活细胞达到治疗疾病的新型口服给药系统。为了构建一种能有效防治2型糖尿病的酵母生物药物,文章首先构建了酿酒酵母(S.cerevisiae)整合型表达载体p NK1-PGK,并且通过绿色荧光蛋白(GFP)证明其表达功能正常,利用该载体将10?GLP-1(Glucagon-like peptide-1)基因转化到酿酒酵母INVSc1中,通过营养缺陷型和Western blotting成功筛选出表达10?GLP-1的长效促胰岛素降糖酵母(Long-acting GLP-1 hypoglycemic yeast,LHY)。该酵母生长迅速,外源基因10?GLP-1表达稳定,表达量达到1.56 mg/g细胞湿重。通过链脲佐菌素和高脂高糖饮食联合诱导的方法构建了2型糖尿病小鼠模型,用LHY对其进行口服灌胃治疗,证明LHY具有较好疗效,明显降低血糖水平。     

甘肃省生境质量变化的图谱特征

生境质量是影响地区生态系统服务价值和保护地球生态系统中生物多样性的重要因素。以地处三大自然区交汇带的甘肃省为研究对象,在定量估算地区2000—2018年生境质量水平基础上,基于图谱变化分析理论和InVEST模型,探索地区生境质量时空分异格局及其图谱转移状态和变化强度。结果表明: 2000—2018年,甘肃省生境质量总体维持中等水平并略有提升,在空间上自北向南呈逐级递增的阶梯式变化特征,在数量上则高低并存;从图谱转移视角分析,甘肃省生境质量格局较为稳定,未发生状态转移的图谱单元占主导,而在发生了生境质量状态转移的图谱单元中,“较高较低”、“较高高”、“较高低”这6类状态间的互换转移最显著,空间分布也较为集聚; “北剧南和”是甘肃省生境质量变化强度的主要格局,自北向南依次为“强变区”、“复合区”、“温缓区”和“平和区”4类变化强度区。     

基于景观格局的祁连山国家公园景观生态风险评价

为探析祁连山国家公园景观格局演变对景观生态风险的影响及为科学管理祁连山国家公园提供理论依据, 便于合理的保护和发展生态系统。以祁连山国家公园2000—2018年Landsat遥感影像解译数据为基础, 利用GIS空间分析技术和Fragstats4软件计算景观格局指数, 对研究区的景观结构的组成及其转化进行了分析, 在此基础上构建了景观生态风险指数, 并通过空间自相关性分析了景观生态风险变化。结果表明: (1)从整个景观来看, 景观破碎化程度相对较低, 其中, 森林景观破碎度显著增加, 水域破碎度和分离度最高, 不同景观类型干扰度特征差异较大。(2)研究区的区域景观生态风险等级面积中, 以低生态风险区为主导, 高生态风险区和较高生态风险区面积占比均较小, 但增长幅度较其他风险等级区高, 较低生态风险区和中等生态风险区面积总体呈下降趋势。(3)各时期景观生态风险度的Moran’s I值分别为0.633, 0.526, 0.547, 表现出空间正相关性, 空间上趋于聚集。人类活动干扰是导致该区域景观生态风险升高的主要原因。     

青海湖地区5株 H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列进化分析

2012年7~9月从来源于青海湖地区活禽市场的环境样本中分离到5株H9N2亚型禽流感病毒,为了了解其基因遗传进化情况,本研究通过RT-PCR技术扩增分离毒株的8个基因片段,并进行全基因序列测定。对其分子特征及全基因序列进行遗传进化分析。结果显示5株病毒的HA基因片段的核苷酸相似度为93.2%~99.1%。NA基因核苷酸的相似度为94.5%~99.8%。A/environment/qinghai/017/2012的裂解位点为PSKSSRGLF,其它4个毒株的HA裂解位点均为PSRSSRGLF。5个病毒的HA基因第226位受体结合位点均为L。M1基因片段中发生了N30D和T215A替换。遗传进化分析表明5株病毒同2005年湖南分离的A/chicken/Hunan/5260/2005(H9N2)毒株类似,为一种重配基因型禽流感病毒。其中HA、NA、NS基因片段属于Y280-like支系,MP基因片段属于G1-like支系,NP、PB1、PB2、PA四个基因片段属于F98-like支系。     

降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备

目的:高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白,制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体。方法:大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后,利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后,经质谱、Western blot和间接ELISA法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性;重组蛋白免疫小鼠,经细胞融合及筛选制备抗PCT单克隆抗体(m Ab)。结果:在大肠杆菌中高效表达了人PCT蛋白;重组人PCT蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性;经筛选获得7株抗PCT单克隆抗体细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与PCT抗原有良好的特异性反应。结论:利用重组人PCT蛋白免疫制备了抗人PCT单克隆抗体,为进一步研发PCT快速诊断试剂提供了原料。     

PNP降解相关基因温敏突变株的分离及其特性研究

通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变株中得到1株温度敏感型突变株MT54。根据转座子上的已知序列设计引物以MT54基因组DNA为模板进行PCR扩增,证实MT54的染色体中有转座子插入。MT54在30℃条件下能够以对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)为唯一碳源生长,但在37℃不能生长。格里斯试色剂法检测NO_2~-的生成情况进一步证明了MT54的这种特性。通过30℃和37℃两种温度条件下MT54和原始出发菌株DLL-E4对PNP和对苯二酚降解情况的比较,推测温敏突变位点可能发生在与PNP降解相关的基因中。     

樟子松人工固沙林衰退的主要特征

针对辽宁省章古台地区樟子松人工固沙林出现的衰退枯死现象,系统地研究了樟子松人工固沙林衰退的主要特征.结果表明,衰退的樟子松人工固沙林外貌景观呈灰绿色,针叶纤细,开花结实率低,平均单株球果数量为10.4～16.5个,成熟种子千粒重为6.96～7.39g,种子空粒、涩粒较多.生长季内2年生针叶营养元素季节变化规律相似,但N、P含量下降,K含量明显增高,表明养分循环失调;衰退林分2年生针叶叶绿素含量较高,健康林分1年生较高且增幅较大.松枯梢病的侵害是樟子松人工固沙林衰退的最明显标志.林分衰退后,树高和胸径生长量下降明显,林分胸径分布结构“左移”(径级小的株数增多),衰弱(亡)木数量增加了15.9%～27.2%;根量分别减少了22.9%～28.9%,其中吸收根减少量最大.     

芋螺毒素MrIA的串联表达、纯化及生物活性鉴定

芋螺毒素(Conotoxins,CTxs)是一类特异作用于离子通道和膜受体的小分子多肽,是研究受体结构和功能及其相关疾病的重要工具。Mr IA是进入临床研究可用于镇痛治疗的一种T超家族的芋螺毒素。传统获取芋螺毒素是通过化学合成的方法,成本高、产量低。实验利用串联表达技术,构建原核表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中成功表达了芋螺毒素Mr IA(recombinant Mr IA,r Mr IA)。通过溴化氰切割和纯化,最终1L菌液可获得纯度高达95%的r Mr IA30mg。小鼠热板实验表明,r Mr IA具有较好的镇痛活性。这为大量获得Mr IA以及其他芋螺毒素小肽的表达提供了方法。     

survivin 基因在化疗药物诱导的 喉鳞癌Hep- 2 细胞凋亡中的作用

目的：探讨survivin基因在化疗药物三氧化二砷（As2O3）和顺铂（DDP）诱导的喉鳞癌（Hep-2）细胞凋亡中的作用。方法：用Hep-2细胞株进行培养传代,以不同浓度的As2O3和DDP作用于Hep-2细胞,MTT观察As2O3和DPP对Hep-2细胞生长的抑制情况,TUNEL法检测细胞凋亡数量,用RT-PCR方法检测survlvin基因的表达。结果：As2O3和DDP对Hep-2细胞的生长均有抑制作用,具有时间-剂量依赖性,化疗药物组细胞凋亡率和survivin基因表达抑制率高于对照组。结论：在As2O3和DPP诱导的Hep-2细胞凋亡中survivin基因表达被抑制,survivin基因可能在DPP和As2O3抗肿瘤中发挥重要作用。