黄孢原毛平革菌抗营养阻遏产漆酶诱变育种及其产酶特性

【目的】筛选能抗营养阻遏产漆酶的黄孢原毛平革菌,论证其产漆酶的确定性及抗营养阻遏产木质素酶的可行性,为白腐菌产酶代谢调控、木质素降解机理的研究奠定基础。【方法】利用重复紫外诱变法,以愈创木酚富氮鉴别培养基筛选目标菌株;比较不同营养条件下菌体生长与产酶动力学差异研究产酶营养调控机理;通过热处理、排除锰离子和加入过氧化氢酶等不同措施论证黄孢原平毛平革菌能否产生漆酶。【结果】3种不同方法均证实选育到的pcR5305和pcR5324菌株在限氮与富氮条件下均能产生漆酶,pcR5305和pcR5324在限氮条件下产漆酶分别达到203.5、187.6 U/L;在富氮条件下为220.6、183.9 U/L,而原菌株pc530在两种条件下都基本不产生漆酶。二菌株产漆酶调控方式不同,pcR5305漆酶产生与菌体生长同步,而pcR5324漆酶产生却受营养氮阻遏。二菌株同时具有抗营养阻遏高产木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)(分别为LiP 1343.2、MnP 252.2 U/L;LiP 1169.5、MnP 172.4 U/L)的能力。【结论】筛选到的黄孢原毛平革菌变异菌株能产漆酶,同时表现了抗营养阻遏产漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的能力,具有重要的生产应用与理论研究价值,为白腐菌产酶代谢调控机理研究提供了原始菌株并奠定了良好的基础。     

茉莉酸信号受体COI蛋白家族的分子进化与基因表达分析

茉莉酸(Jasmonic acid,JA)存在于所有高等植物中,是植物对病原微生物和虫害防御反应的关键激素。在茉莉酸信号转导中,COI1(COR-insensitive 1)作为茉莉酸信号受体蛋白在其中发挥关键作用。本研究采用生物信息学方法,从藻类、苔藓类、蕨类、裸子及单、双子叶植物多谱系对COI蛋白家族进行比较基因组学研究,并取得以下结果:(1)同源基因鉴定结果发现,在所选的7种陆生植物中一共鉴定了55个COIs同源基因,然而,在低等的水生植物包括绿藻类(Chlorophytes)、红藻类(Rhodophytes)、硅藻类(Bacillariophytes)、灰胞藻类(Glaucophytes)及褐藻类(Phaeophytes)等基因组中均未发现其同源基因;(2)系统进化树分析表明,植物COI蛋白家族可以分为4个保守的亚家族,且在陆生植物扩增的同时可能已发生功能分化;(3)基因结构分析显示,植物COI家族基因结构表现多样性,主要体现在内含子的数目和长度上;(4)基因表达数据提示,COI基因家族成员参与植物生长发育的多个时期,且在不同组织器官以及不同的胁迫应答反应中发挥不同的作用。以上结果将为植物COI基因家族的深入研究提供参考。     

四氢紫堇萨明对Aβ_(25-35)诱导AD细胞模型凋亡的影响及其机制研究

探讨四氢紫堇萨明(SQZJSM)对阿尔茨海默病(AD)细胞模型凋亡的影响及作用机制。采用Aβ_(25-35)诱导神经细胞PC-12损伤建立AD细胞模型,通过流式细胞仪检测凋亡率,高通量高内涵分析系统观察细胞核形态并检测线粒体膜电位(MMP)变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。结果显示,SQZJSM可改善模型细胞受损的细胞核形态,同时显著减少模型细胞凋亡率和胞质Cyt C含量,上调MMP,降低Bax、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白表达,增加Bcl-2、p-Akt/T-Akt表达(P 0. 05); PI3K/AKT抑制剂LY294002可阻断SQZJSM对模型细胞的上述改善作用。以上结果表明四氢紫堇萨明可显著改善Aβ_(25-35)诱导的AD细胞模型凋亡,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路调控内源性线粒体凋亡途径相关。     

母源性PM_(2.5)暴露致子代鼠大脑皮层神经炎症与星形胶质细胞和小胶质细胞激活

目的探讨母源性PM_(2.5)暴露导致子代鼠大脑皮层神经炎症发生的机制。方法利用改良快速小鼠气管滴注法,建立妊娠期PM_(2.5)暴露的动物模型。将孕鼠随机分为空白组,对照组,PM_(2.5)低、中、高剂量组。ELISA检测出生后1d、7d、14d、21d、30d子代鼠大脑皮层炎症因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的表达变化。免疫荧光双标染色和激光共聚焦显微镜技术检测14d子代鼠大脑皮层神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的变化及凋亡情况。结果 ELISA检测发现,PM_(2.5)中、高剂量组子代鼠在出生后7、14、21d时,大脑皮层中TNF-α、IL-1β和IFN-γ的表达均增多。免疫荧光染色结果显示,PM_(2.5)中、高剂量组子代鼠出生后14d时,大脑皮层额叶区GFAP和Iba1荧光强度增强,NeuN荧光强度则降低;TUNEL/NeuN双阳性细胞、TUNEL/GFAP双阳性细胞和TUNEL/Iba1双阳性细胞随着PM_(2.5)剂量增加均增多。结论母源性PM_(2.5)暴露可导致子代发育过程中大脑皮层星形胶质细胞和小胶质细胞激活,这是导致子代大脑皮层出现持续神经炎症的直接途径。     

茉莉酸信号途径中转录抑制因子JAZ蛋白家族的分子进化分析

茉莉酸在植物的生长发育、应激反应和次生代谢过程中起着重要的调控作用。转录抑制因子JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白则是茉莉酸信号从SCF^coi1受体复合物向下游茉莉酸应答基因转导的纽带。采用比较基因组学的方法。从多谱系的角度对植物JAZ蛋白家族进行分子进化分析并取得以下研究结果。（1）在藻类植物、苔藓植物、蕨类植物、裸子植物及单、双子叶植物6个不同谱系的15种代表植物基因组中,鉴定了82个JAZ同源基因,其中在低等藻类植物基因组中没有鉴定到JAZ同源基因,提示JAZ家族基因可能起源于陆生植物。（2）系统发育分析表明,在植物基因组中JAZ蛋白家族可分为10个保守的亚家族,而谱系特异扩增尤其是串联重复和区段重复可能是陆生植物JAZ家族基因扩增与进化的主要机制,并导致多个谱系特异的JAZ亚家族产生。（3）基因结构分析表明,JAZ家族基因含有0一7个数目不等、62—4222bp长度不等的内含子,提示在植物基因组进化过程中,JAZ家族基因可能发生内含-丢失或内含子插入缺失,进而导致基因外显子．内含子结构的多样性。该研究结果将为植物JAZ蛋白家族的深入研究提供参考。     

四氢紫堇萨明对AD细胞模型Tau蛋白磷酸化的影响及其可能机制研究

研究四氢紫堇萨明对Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病细胞模型Tau蛋白磷酸化的影响及其可能作用机理。以神经细胞PC-12为载体,Aβ25-35诱导48h建立AD细胞模型,MTS试剂盒检测细胞活力,激光共聚焦显微镜观察细胞核和细胞微管变化情况,Westernblot法检测蛋白表达水平。结果显示,四氢紫堇萨明可显著增强模型细胞活力,改善微管形态,降低p-Tau(Ser396)和p-GSK-3β(Tyr216)表达水平,升高p-GSK-3β(Ser9)和p-AKT表达水平(P<0.05);PI3K抑制剂LY294002可部分阻断四氢紫堇萨明对模型细胞的上述改善作用。以上结果表明四氢紫堇萨明可显著改善AD细胞模型Tau蛋白过度磷酸化,从而改善细胞骨架微管形态,增强细胞活力,其机理可能与激活PI3K/Akt信号通路,降低GSK-3β活性,改善蛋白激酶/蛋白磷酸酯酶系统失衡相关。     

苹果蔗糖载体蛋白MdSUT1多克隆抗体的制备及MdSUT1蛋白表达特异性分析

高等植物光合同化产物蔗糖的质外体运输主要是靠蔗糖载体蛋白来完成的。MdSUT1是从苹果果实中克隆的蔗糖载体家族基因,本文将MdSUT1构建到酵母表达载体pMETαB,重组质粒转化毕赤酵母PMAD16经0．5％甲醇诱导后获得Md—SUT1表达。纯化的MdsuT1异源表达蛋白免疫Balb／C小鼠制备多克隆抗体,抗体特异性分析结果显示该抗体对酵母表达和苹果中的MdsuT1识别具有较高的特异性。免疫共沉淀实验结果也证明抗体能够应用于苹果果实中MdSUT1的功能分析。     

黄孢原毛平革菌突变株抗碳氮营养阻遏产漆酶碳氮生理调控机理

【目的】通过比较不同碳氮营养及其消耗对产漆酶的影响,了解白腐菌模式种黄孢原毛平革菌解除营养阻遏产漆酶代谢的生理生态特性,揭示白腐菌合成漆酶的碳氮生理调控机理。【方法】分别利用限碳限氮(CL-NL)、限碳富氮(CL-NS)、富碳限氮(CS-NL)与富碳富氮(CS-NS)4种条件培养黄孢原毛平革菌野生型(WT)与突变株,比较两者产漆酶动力学、菌体生长、葡萄糖与氨氮消耗差异及其相关性来揭示解除营养阻遏产漆酶调控生理特性,明确C、N营养对产漆酶的生理调控途径。【结果】突变菌株除消耗速率比野生型略慢外,两者氨消耗趋势一致,但对葡萄糖的消耗比野生型快且氨氮浓度对葡萄糖的消耗影响不大。在CL-NL、CL-NS、CS-NL、CS-NS 4种培养条件下,野生型分别在培养后期的第11、14、19和19天的次生代谢时期产生0.107、0.029、12.84和18.05U/L漆酶,启动漆酶合成及酶峰值出现的时间与基质中葡萄糖耗尽或接近耗尽的时刻,或同氨氮消耗至最低值的时刻相对应;与WT产漆酶特性不同,突变株产漆酶伴随整个培养过程且均有两个产酶高峰,分别在培养的第8、7、12天和12天出现298.83、343.14、271.22、251.49U/L漆酶第一个产酶高峰,在培养的第12、13、19和19天产生257.69、298.78、213.81、216.93U/L漆酶的第二个产酶高峰。碳氮营养对产酶的影响显示:两菌株只要初始碳源浓度相同(限碳或富碳),各自产酶动力学趋势基本一致;相反,即使初始氮源浓度相同但其产酶动力学趋势却不同,说明碳源对黄孢原毛平革菌产漆酶的影响比氮源更为重要。【结论】野生型黄孢原毛平革菌产漆酶受碳或氮饥饿调控,碳、氮各自独立发挥作用且在不同的营养条件下由不同营养素所调控,如在限碳条件下产漆酶主要由葡萄糖饥饿启动,而在富碳条件下则由氨氮饥饿所激发,以碳或氮菌体负荷表示是否达到启动酶合成的调控阀值比单纯碳或氮浓度更为合理。突变菌株漆酶合成的启动不受碳、氮营养所阻遏,可能涉及一个全局调控的改变,解除了漆酶合成的营养阻碍。     

一氧化氮在启动黄孢原毛平革菌木质素降解酶合成中的作用

[目的]通过了解一氧化氮在启动黄孢原毛平革菌合成木质素过氧化物酶(LiP)中的作用及其作用机制,弄清白腐菌启动次生代谢的调控机制.[方法]以黄孢原毛平革菌原种pc530及突变种pcR5305为研究对象,弄清在不同营养条件下NO含量的动态变化及其与合成LiP之间的关系,再通过添加外源NO供体SNP、NO淬灭剂cPTIO对两菌株合成LiP的影响分析,揭示NO在白腐菌启动合成LiP中的作用和作用机理.[结果]两菌株均能在两种不同营养条件下产生NO,但NO的产生量与菌株及其营养状况有关,富营养使pc530产生NO量低且严重延后,而pcR5305产生NO并不需要营养饥饿激发且产生量显著高于pc530.除了LiP峰值出现时间迟于NO峰值时间外,NO含量与LiP合成呈正相关性;外施SNP对合成LiP有促进作用,但对pcR5305的促进作用没有pc530明显;15 mmol/L cPTIO使黄孢原毛平革菌合成LiP均大为降低,但并没有完全抑制产生LiP.[结论]黄孢原毛平革菌可能通过产生NO启动LiP的合成,但NO并不直接参与或影响合成LiP,NO更可能是作为一种上游的信号分子起作用.除了NO外,可能还有其它与NO有相互促进作用的信号分子也参与了LiP合成的调控.与pc530具有不同的产生NO的机制可能就是pcR5305抗营养阻遏合成木质素降解酶的机理.     

黄孢原毛平革菌抗营养阻遏产漆酶同工酶动态分析

以选育的抗营养阻遏产木质素降解酶黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）pcR5305、pcR5324为实验对象,研究了其在富氮条件下动态产漆酶同工酶的规律及其可能的营养调控机制。两菌株可在初始氨氮质量浓度达2.2 g/L的富氮环境下产漆酶,启动漆酶合成及达到产酶峰值对应的葡萄糖、氨氮浓度阀值远高于野生型,基质C/N的降低是漆酶合成启动及达到高峰的前提,其中碳浓度的降低更为重要。两菌株在不同时间可产生1～3种漆酶同工酶（分别为Lac1、Lac2和Lac3）,其中Lac3产酶伴随菌体整个生长过程,其合成启动与积累无需受基质碳氮饥饿及C/N的限制;Lac2在pcR5305初生代谢阶段产生,但只能在pcR5324次生代谢阶段产生;Lac1仅在pcR5305的初生代谢或次生代谢阶段产生,基质C/N降至5.0～7.0时诱导产生 Lac1的合成,并随培养时间的增加产酶量逐渐提高。显然3种同工酶的合成具有不同的调控机制。