环境微生物群落功能研究的新方法和新策略

微生物群落在驱动生物地球化学循环中扮演着重要角色,传统的研究方法可对微生物群落进行遗传结构的解析,但不能有效地与功能研究耦联.概述了近年发展起来的基于核酸和蛋白质水平的分子生物学新方法--环境mRNA 和 rRNA同时荧光原位杂交(FISH)、寡核苷酸微阵列技术(Oligonucleotide Microarray)、 稳定性同位素联合宏基因组学(SIP-enabled Metagenomics)和环境蛋白质组学(Metaproteomics)在环境微生物群落功能研究中的应用,并且对其发展趋势进行了分析和展望.     

费氏中华根瘤菌HN01DL在大豆根圈的定殖动态与结瘤研究

以发光酶基因luxAB为标记,在根盒缩影条件下研究了费氏中华根瘤菌HN01DL在大豆根圈的定殖动态、分布范围及其结瘤情况.结果表明,HN01DL在根盒灭菌土壤和非灭菌土壤缩影中的大豆全根系定殖动态与水平明显不同,前者在第12d时达到最高定殖密度(8.65logcfu·g^-1),而后者的早期定殖数量下降较快,且于第15d时达到最高定殖密度(6.88logcfu·g^-1).HN01DL在大豆播种5d后在大豆根部的A(0～4cm)区根段上达到最高定殖密度(7.05logcfu·g^-1),然后开始缓慢下降,至第19d时仍维持相对稳定,在第33d时又开始回升.至播种后第46d时HN01DL可散布至种子下方16cm处的根段部位.HN01DL在A区根段的定殖密度持续较高,所形成的发光根瘤总数(16.3个)及发光比例(68.8%)最高,且发光根瘤主要集中于该区段主根上.发光根瘤比例沿A-E区段逐渐下降,在E区段未检测到发光根瘤.     

华癸中慢生根瘤菌7653R 3个脂质转运蛋白基因的克隆、突变及共生表型北大核心CSCD

【目的】脂类转移家族蛋白基因编码一类参与脂类转运及代谢的蛋白。本研究旨在构建华癸中慢生根瘤菌3个脂质转运家族蛋白基因的突变株,检测及分析突变体与紫云英共生条件下的表型及功能。【方法】利用生物信息学分析与预测转脂蛋白的结构特征及功能,采用荧光定量技术检测目标基因在自生和共生条件下的表达特性,通过插入突变技术构建目标基因突变株,并进行植物盆栽实验考察其共生表型。【结果】MCHK-5577、MCHK-2172和MCHK-2779基因编码蛋白属于START/RHO alpha_C/PITP/Bet_v1/Cox G/Cal C(SRPBCC)超家族,包含脂类转移结构域,参与脂类转运或代谢,与百脉根等中慢生根瘤菌相应基因的序列相似性达95%以上。这3个基因在共生条件下的表达水平都增高。分别构建了MCHK-5577、MCHK-2172和MCHK-2779基因突变菌株,与野生型菌株7653R相比,接种突变株MCHK-2172mut、MCHK-2779mut和MCHK-5577mut后的植株地上部分生物量和根瘤固氮酶活性显著降低。【结论】华癸中慢生根瘤菌脂质转移家族蛋白基因在共生互作过程中发挥重要作用,突变后明显影响共生固氮表型。本文的实验结果为深入研究脂类转移蛋白在共生固氮作用中的功能机制奠定了基础。     

华癸根瘤菌7653R中一个RND型药物外排泵的功能表型及调控鉴定

【目的】研究华癸根瘤菌7653R中MCHK_0866和MCHK_0867编码的RND家族外排泵的功能表型。【方法】对外排泵编码基因及候选调控基因在基因组上的结构进行分析。采用测定OD_(600)观察菌株生长曲线的变化。通过测定最低抑菌浓度检测菌株的药物敏感性,RT-PCR检测目的基因经特定物质处理后表达量的变化。通过细菌单杂交系统初步检测外排泵的转录调控。【结果】MCHK_0866和MCHK_0867所编码蛋白共同组成一个RND家族射流泵。缺失该外排泵后,细菌生长曲线在稳定期OD_(600)数值降低,对萘啶酸、四环素和SDS的敏感性发生变化,萘啶酸处理细菌后2个基因的表达量增加。同时,下游属于Tet R转录因子家族的基因MCHK_0869表达产物作用于MCHK_0867的启动子区域。【结论】该外排泵与萘啶酸的运输有关,缺失后自身生长受到影响,表达受到下游转录因子的调控。     

一株海洋细菌的初步鉴定及其产黑色素相关新基因(簇)的分离

对分离自近海沼泽地大米草根际的一株供试海洋细菌MWYL1进行了形态观察、生理特性检测以及16SrDNA序列分析。实验结果表明:该菌株属于海洋单胞菌属(Marinomonas),革兰氏染色呈阴性,直杆状,好氧生长,适于28℃生长。基于16SrDNA序列的Blast分析表明,菌株MWYL1与Marinomonas pontica和Marinomonas dokdonensis的序列相似性分别为97%和95%。通过基因组fosmid文库的构建,直接分离到一个产生黑色素的克隆,进一步亚克隆和测序后获得与黑色素产生相关的功能新基因(簇),并且对其进行了生物信息学的初步分析。     

接种量对费氏中华根瘤菌HN01DL根圈定殖与结瘤的影响

在灭菌土和未灭菌土盆栽系统中 ,研究了大豆种子的表面初始接种量对费氏中华根瘤菌HN0 1DL在大豆根圈中的定殖动态与结瘤的影响。结果表明 ,与 3个接种量对应的早期根圈定殖动态和水平有明显差异 ,但随着宿主植物根系的生长其差异逐渐减小 ,整个定殖动态曲线的变化和定殖密度趋向一致 ,并且发现 3个不同的初始接种量对HN0 1DL在大豆黑农 33根系上的结瘤数量和占瘤率没有显著影响。     

费氏中华根瘤菌HN01DL在大豆根圈能定殖动态与结瘤研究

以发光酶基因luxAB为标记,在根盒缩影条件下研究了费氏中华根瘤菌HN01DL在大豆根圈的定殖动态、分布范围及其结瘤情况．结果表明,HN01DL在根盒．灭菌土壤和非灭菌土壤缩影中的大豆全根系定殖动态与水平明显不同,前者在第12d时达到最高定殖密度(8．65log cfu·g^-1),而后者的早期定殖数量下降较快,且于第15d时达到最高定殖密度(6．88log cfu·g^-1)．HN01DL在大豆播种5d后在大豆根部的A(0～4cm)区根段上达到最高定殖密度(7．05log cfu·g^-1),然后开始缓慢下降,至第19d时仍维持相对稳定,在第33d时又开始回升．至播种后第46d时HN01DL可散布至种子下方16cm处的根段部位．HN01DL在A区根段的定殖密度持续较高,所形成的发光根瘤总数(16．3个)及发光比例(68．8％)最高,且发光根瘤主要集中于该区段主根上．发光根瘤比例沿A-E区段逐渐下降,在E区段未检测到发光根瘤．     

导入额外拷贝nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

以广宿主、稳定性质粒pTR102为载体构建重组质粒pHN306,其上克隆有来自肺炎克氏杆菌（Klebsiellapneumoniae）的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶标记基因（luxAB）。经三亲本接合转移,将pHN306导入费氏中华根瘤菌（Sinorhizobiumfredii）HN01,GR3和YC4。与出发菌相比较的盆栽试验结果表明：HN01（pHN306）和GR3（pHN306）分别在大豆渝豆一号和黑龙33上能显著提高瘤数,瘤重,植株地上部分干重和总氮量,YC4（pHN306）在大豆渝豆一号上也能显著提高瘤数,癌重和总氮量,对植株地上部分干重表现出一定的促进作用。结果表明：nifA基因对固氮效率和结瘤能力的促进作用与受体根瘤菌和大豆品种等因素有关。以luxAB为报告基因进行的菌落和根瘤发光检测结果表明：pHN306可在供试根瘤菌中稳定遗传。     

华癸根瘤菌urtB基因突变株的构建与共生固氮表型分析

【目的】尿素ABC转运体透性酶亚基编码基因urtB可能参与尿素代谢及支链氨基酸转运;本文旨在获得实验证据阐明urtB基因对华癸根瘤菌结瘤和固氮的影响,为深入研究其功能机制提供一定的科学依据。【方法】利用生物信息学分析urtB基因的结构特征及生物学功能,通过荧光定量检测urtB基因在自生和共生条件下的时空表达特征和启动子原位表达技术检测urtB基因组织表达特征,采用插入突变构建urtB突变株,通过植物盆栽并结合添加氮素处理,检测与分析突变体的共生固氮表型变化。【结果】分析表明urtB基因对于氮素转运非常重要,在共生条件下的表达水平比自生培养条件下显著上调表达;在成熟根瘤的固氮区中大量表达;正确构建和筛选获得了根瘤菌urtB突变株;接种urtB突变株与野生型菌株7653R相比较,突变体根瘤发育异常;植株地上部分生物量和根瘤固氮酶活性显著降低;添加氮素可恢复其共生缺陷表型。【结论】华癸中慢生根瘤菌urtB基因可能通过影响根瘤中氮转运或同化,进而在根瘤发育与共生固氮中发挥重要作用。     

华癸中慢生根瘤菌7653R MCHK-3535基因在自生和与紫云英共生中的功能

【目的】探究Mesorhizobium huakuii 7653R MCHK-3535基因在共生固氮中的功能。【方法】构建MCHK-3535插入失活突变体、超表达和互补菌株,对其进行共生表型鉴定;并测定各菌株的生长曲线、运动性及生物膜形成;利用qRT-PCR方法和组织表达定位分析MCHK-3535在共生过程中的时空表达特征。【结果】与野生型7653R相比,突变体Δ3535达到稳定期的生物量增加,运动性下降,生物膜形成增加。此外,MCHK-3535基因的失活会显著提高紫云英固氮能力和植物地上部分鲜重,但不影响根瘤数量及重量;且互补菌株C3535能部分回补到野生型性状,超表达菌株OV3535均无显著性差异;qRT-PCR和启动子组织表达定位发现,MCHK-3535基因主要在根瘤的侵染区、过渡区及固氮区表达,并且表达持续整个固氮期。【结论】MCHK-3535基因在自生及与紫云英共生过程中发挥重要功能,参与根瘤的正常发育并负向调控固氮酶活性。