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1.
【背景】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展。【目的】原核表达PPRVH蛋白,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因。将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E. coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达。以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体。【结果】重组E. coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7 h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli(pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6400-1:25600之间。【结论】原核表达了PPRVH蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础。  相似文献   
2.
研究了层理鞭枝藻藻胆体在不同浓度磷酸缓冲溶液中解离过程中荧光发射光谱的变化和光能传递。完整藻胆体的77K荧光光谱中只有一个峰,位于685nm它是末端发射体(核心-膜连接多肽和别藻蓝蛋白-B)的荧光峰。部分解离藻胆体的荧光光谱的主峰位移至652nm:次峰位于685nm;660nm为一弱荧光发射肩。它们依次为C-藻蓝蛋白,末端发射体和别藻蓝蛋白的荧光。严重解离藻胆体的荧光主峰移644nm;次峰由685nm移至682nm;660nm荧光发射肩消失。这表明C-藻蓝蛋白所捕获的光能已不能传递给别藻蓝蛋白,但可传递给末端发射体洞时又表明C-藻蓝蛋白不仅与别藻蓝蛋白相连接而且还与末端发射体相连接。提出该藻胆体光能传递链如下:核心-膜连接多肽藻红蓝蛋白→C-藻蓝蛋白→别藻蓝蛋白别藻蓝蛋白-B  相似文献   
3.
【背景】由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV S蛋白可以诱导宿主产生中和抗体。【目的】原核表达PEDV CV777疫苗株S2截短肽(aa:961-1 382)并制备其多克隆抗体;鉴定表达的S2截短肽上的线性B细胞表位区。【方法】将经密码子优化的PEDV S2截短肽编码DNA (s2t)克隆至载体p ET-28a中并转化Escherichia coli BL21(DE3),利用IPTG诱导S2截短肽表达。以经SDS-PAGE切胶纯化的重组S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。在E. coli BL21中GST融合表达覆盖S2截短肽序列全长、彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S2截短肽兔血清为一抗,通过Westernblot(WB)筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S2截短肽上的线性B细胞表位区。【结果】重组PEDV S2截短肽的相对分子质量约为50 kD;诱导4 h表达量最高,且主要形成包涵体。WB结果显示,纯化的S2截短肽能被猪抗PEDV血清识别;以纯化的S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多抗血清,ELISA法检测抗体效价位于1:25 600-1:102 400之间。免疫组化和间接免疫荧光分析均表明,制备的多抗血清可以识别Vero细胞培养的PEDV DR13弱毒株。以制备的多抗血清通过WB从52个GST融合表达的16肽中鉴定到11个阳性反应性16肽。WB分析显示,得到的阳性反应性16肽都可以被猪抗PEDV血清识别。鉴定到的阳性16肽在S2截短肽上形成4个线性B细胞表位区(aa:969-984;1 065-1 096;1 225-1 280;1 361-1 382)。【结论】高效价抗PEDV S2截短肽多克隆抗体的制备和S2截短肽上线性B细胞抗原表位区的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立有效的PEDV检测方法奠定了基础。  相似文献   
4.
【背景】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株与流行毒株S蛋白氨基酸序列比对显示,变异位点主要集中在S蛋白的N端。【目的】鉴定PEDV流行毒株S蛋白高变区(S10A,1-496 aa)的B细胞线性表位肽,特别是流行毒株特异性B细胞表位肽。【方法】以SDS-PAGE割胶纯化大肠杆菌表达的PEDV流行株SD2014 S蛋白高变区片段(S10ASD2014),免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;在E. coli中谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase,GST)融合表达覆盖S10ASD2014序列全长且彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S10ASD2014多抗为一抗,通过Western blot筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S10ASD2014上的B细胞线性表位肽;利用抗PEDV经典毒株(CV777)S蛋白高变区片段(S10ACV777)多抗血清鉴定S10ASD2014上的保守性B细胞线性表位肽。【结果】重组表达的S10ASD2014相对分子质量约为72 kD;纯化的S10ASD2014表位肽能被PEDV阳性血清识别。制备的抗S10ASD2014多抗可以识别PEDV DR13弱毒株。利用抗S10ASD2014血清和抗S10ACV777血清从61个GST融合表达的16肽中鉴定到28个阳性反应16肽,其中13个为2种血清共同识别16肽。对24株PEDV不同亚群代表毒株的对应区域进行同源性分析表明2个阳性16肽为保守性表位肽。【结论】确定了PEDV流行株SD2014 S蛋白高变区的B细胞线性表位肽,B细胞线性表位肽,特别是流行毒株特异性表位肽的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立以表位为基础的PEDV感染检测方法打下良好基础。  相似文献   
5.
【背景】猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)膜蛋白(M)在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用,但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。【目的】利用免疫沉淀技术和液质联用技术筛选细胞内与PEDVM蛋白相互作用的蛋白,为揭示M蛋白在病毒增殖过程中发挥的功能提供研究基础。【方法】将MOI=0.1的PEDV DR13疫苗株接种于长成单层的Vero细胞,感染36 h后,收集细胞并进行裂解。利用抗M的单克隆抗体沉淀与M相互作用蛋白复合物,通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴定并利用细胞功能富集分析(Gene ontology,GO)对感染组鉴定到的细胞蛋白进行分析,确定两个细胞内源性蛋白为候选蛋白,进行免疫共沉淀(Co-IP)验证和共定位分析。【结果】基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了218个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42 (Cell division cycle 42,CDC42)、真核翻译起始因子3亚基L蛋白(eIF3L)为候选蛋白进行Co-IP(Co-immunoprecipitation)验证和共定位分析,结果证实CDC42、eIF3L蛋白分别与M蛋白在细胞内存在相互作用。【结论】鉴定出PEDV M蛋白能够与宿主细胞CDC42和eIF3L蛋白相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白60个,为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。  相似文献   
6.
对螺旋藻(Spirulinaplatensis)藻胆体在室温和77K处于不同浓度磷缓冲溶液和不同解离时间的荧光发射光谱进行了研究。藻胆体在0.9mol/L磷酸缓冲溶液中,由于没有发生解离,光能传递效率高,在77K荧光发射光谱中只有一个峰,位于687nm,属于别藻蓝蛋白-B。当藻胆体悬浮在0.3mol/L磷酸缓冲溶液中1分钟,77K荧光光谱的主峰出现在684nm.又出现655nm和666nm荧光峰,它们依次属子C-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。在2小时;655nm荧先峰成为主峰,684nm荧光峰为次峰,666nm荧光肩消失。这表明C-藻蓝蛋白所捕获的先能已不能传递给别藻蓝蛋白,但能传给别藻蓝蛋白-B。我们提出在螺旋藻藻胆体中存在两类C-藻蓝蛋白,一是与别藻蓝蛋白相连接,另一是与别藻蓝蛋白-B相连接。  相似文献   
7.
对螺旋藻(Spirulinaplatensis)藻胆体在室温和77K处于不同浓度磷缓冲溶液和不同解离时间的荧光发射光谱进行了研究。藻胆体在0.9mol/L磷酸缓冲溶液中,由于没有发生解离,光能传递效率高,在77K荧光发射光谱中只有一个峰,位于687nm,属于别藻蓝蛋白-B。当藻胆体悬浮在0.3mol/L磷酸缓冲溶液中1分钟,77K荧光光谱的主峰出现在684nm.又出现655nm和666nm荧光峰,它们依次属子C-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。在2小时;655nm荧先峰成为主峰,684nm荧光峰为次峰,666nm荧光肩消失。这表明C-藻蓝蛋白所捕获的先能已不能传递给别藻蓝蛋白,但能传给别藻蓝蛋白-B。我们提出在螺旋藻藻胆体中存在两类C-藻蓝蛋白,一是与别藻蓝蛋白相连接,另一是与别藻蓝蛋白-B相连接。  相似文献   
8.
研究了层理鞭枝藻胆体在不同浓度磷酸冲溶液中解离过程中荧光发射光谱的变化和光能传递,完整藻胆体的77K荧光光谱中只有一个峰,位于685nm,它是末端发射体(核心-膜连接多肽和别蓝蛋白-B)的荧光峰,部分解离藻胆体的荧光光谱的主峰位移至652nm,次峰位于685nm;660nm为一弱荧光发射肩,它们依次为C-藻蓝蛋白,末端发射体和别藻蓝蛋白的荧光。严重解离藻胆体的荧光主峰移至644nm;次峰由685n  相似文献   
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