ELP[Ⅰ]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

[目的]使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein,ELP) ELP[Ⅰ]50作为非色谱纯化标签,分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并研究聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对ELP[Ⅰ]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition,Tt)的影响.[方法]人工合成Trx基因,将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[Ⅰ]50标签下游,转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达.融合蛋白表达后,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)分离纯化,并检测不同浓度PEG时的Tt值.[结果]成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[Ⅰ]50-Trx,检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时,Tt为28.6℃;而当PEG的浓度为5％、10％、15％、20％时,Tt分别降至22.3℃、15.9℃、6℃、0℃.[结论]ELP[Ⅰ]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势,而PEG能降低蛋白的Tt值,进一步增强分离纯化效果,扩大使用范围,可望应用于分离纯化多种重组蛋白.     

ELP[I]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

【目的】使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein, ELP) ELP[I]50作为非色谱纯化标签, 分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx), 并研究聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)对ELP[I]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition, Tt)的影响。【方法】人工合成Trx基因, 将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[I]50标签下游, 转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达。融合蛋白表达后, 采用可逆相变循环(Inverse transition cycling, ITC)分离纯化, 并检测不同浓度PEG时的Tt值。【结果】成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[I]50-Trx, 检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时, Tt为28.6 °C; 而当PEG的浓度为5%、10%、15%、20%时, Tt分别降至22.3 °C、15.9 °C、6 °C、0 °C。【结论】ELP[I]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势, 而PEG能降低蛋白的Tt值, 进一步增强分离纯化效果, 扩大使用范围, 可望应用于分离纯化多种重组蛋白。     

右美托咪定对老年骨质疏松合并股骨颈骨折患者术后苏醒质量、定量脑电图和谵妄的影响

摘要 目的：探讨右美托咪定（Dex）对老年骨质疏松合并股骨颈骨折患者术后苏醒质量、定量脑电图和谵妄的影响。方法：选择2016年1月-2021年3月期间我院收治的老年骨质疏松合并股骨颈骨折患者97例,将其根据随机数字表法分为对照组（48例）和Dex组（49例）,两组均行全髋关节置换术治疗,Dex组麻醉诱导前给予0.5 μg/kg Dex,对照组予以等量生理盐水,观察两组术后苏醒质量、血流动力学变化、定量脑电图频率,记录两组谵妄和麻醉不良反应发生情况。结果：与对照组相比,Dex组呼吸恢复时间、拔管时间、睁眼时间更短（P<0.05）。两组手术切皮时（T2）~术毕时（T4）时间点心率（HR）均低于麻醉前（T1）时间点,平均动脉压（MAP）均高于T1时间点,组内对比差异有统计学意义（P<0.05）。Dex组T2~T4时间点HR高于对照组对应时间点,MAP低于对照组对应时间点（P<0.05）。Dex组术后1 d左/右颞区、左/右额区δ波频率低于对照组（P<0.05）。Dex组术后1 d左/右颞区、左/右额区α1波频率高于对照组（P<0.05）。Dex组术后谵妄发生率低于对照组（P<0.05）。两组间麻醉不良反应发生率无统计学差异（P>0.05）。结论：老年骨质疏松合并股骨颈骨折患者手术期间予以Dex,可改善患者术后苏醒质量,且对血流动力学影响较小,可减轻对患者大脑额叶δ、α1波频率的影响,同时降低谵妄的发生率。     

疏水性ELP基因设计与基因库构建

[目的]设计合成疏水性类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)基因,建立ELP基因库.[方法]选择疏水性最强的异亮氨酸(I1e,I)(疏水参数:4.5)取代ELP五肽重复序列单元(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-客座氨基酸-甘氨酸,VPGXG)中客座残基X.全基因合成一段含编码(VPGIG)10序列,上游含Dra Ⅲ酶切位点、下游含BglⅠ酶切位点的ELP单元.将Dra Ⅲ和BglⅠ设计为一对同尾酶(Isocaudarner),利用这对同尾酶定向克隆(Recursive directional ligation,RDL)一系列不同拷贝数的ELP基因.为鉴定基因库有效性,随机选取库中ELP[Ⅰ]50基因进行蛋白表达、纯化并测定其相变温度(Inverse temperature transition,Tt).[结果]建立了ELP[Ⅰ]n(n=10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120)基因库.测定ELP[Ⅰ]50的Tt为24.3℃.[结论]首次单独选用I1e(I)作为ELP蛋白质标签中客座残基氨基酸,增加了ELP中疏水性氨基酸的含量,为进一步筛选出表达量高、Tt低、分子量小的ELP标签奠定基础.     

组成型表达重组人C-反应蛋白的毕赤酵母菌株构建

目的:构建组成型表达重组人C-反应蛋白(Recombinant human C-reactive protein,rhCRP)的毕赤酵母工程菌株,表达、纯化rhCRP并鉴定其免疫反应性。方法:将设计合成的rhCRP基因克隆到表达载体pGAPZαA上并转化至毕赤酵母X-33中进行组成型分泌表达,通过His亲和层析柱纯化rhCRP。分别采用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法检测目的蛋白并鉴定其免疫反应性。结果:重组表达载体pGAPZαA/rhCRP经酶切及DNA测序鉴定构建成功。重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达23kDa的rhCRP,27h即达到最大表达水平,表达量约3mg/L。经一步分离纯化获得纯度为96.58%的rhCRP,经间接ELISA检测表明其具有免疫反应性。结论:成功构建了组成型分泌表达rhCRP的毕赤酵母菌株,为进一步自主研发人CRP检测试剂奠定了基础。     

聚乙二醇对ELP[I]40相变温度的影响

目的:研究聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对类弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)ELP[I]40相变温度(inverse temperature transition,Tt)的影响.方法:设计并合成ELP[I]40基因(由40个(VPGIG)五肽单元串联组成),表达纯化后,检测不同浓度PEG条件下ELP[I]40的Tt.结果:在ELP[I]40终浓度为25 μmol/L时,PEG浓度为5％,10％,15％,20％,25％时分别使Tt由29℃降至26.5℃,22℃,15.2℃,8.8℃,2.5℃.结论:PEG可降低ELP的Tt,可通过PEG促进ELP重组蛋白分离纯化.     

连接肽对融合蛋白ELP[I]_(30)-linker-eGFP相变的影响

研究G4S和Poly N连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响.将编码两种不同连接肽G4S和Poly N的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因克隆到pET28-ELP[I]30表达载体中,在宿主菌E.coli BLR(DE3)中经IPTG诱导表达ELP[I]30-linker-eGFP,通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)及镍柱亲和层析纯化ELP[I]30-linker-eGFP蛋白.结果显示,成功构建、表达具有活性的两种连接肽的融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP,连接肽G4S使融合蛋白产生不可逆相变,而Poly N不影响融合蛋白可逆相变,该研究对类弹性蛋白标签的应用具有指导意义.