利用改进的Oligo-capping法构建手掌参全长cDNA文库

Oligo-capping法是构建全长cDNA文库的重要方法之一.以名贵中药手掌参(Gymnadenia conopseaR.Br.)的幼芽组织为材料,通过减少mRNA的用量,用pUC18作载体,设计特异引物对第1链cDNA进行PCR扩增,按片段大小分级回收cDNA,形成了一种以Oligo-capping法为基础,构建珍稀材料全长cDNA文库的快速、简单的技术体系.利用该方法,首次成功地构建了手掌参的全长cDNA文库.经综合评价,文库容量达到了8×105个/μg cDNA,全长cDNA比例达到68%,重组率超过96%,说明本实验的改进非常成功.该文库的建成为手掌参的遗传资源保护和功能基因发掘等理论与应用研究奠定了基础.     

小麦高分子量谷蛋白亚基Glu-B1位点沉默基因的克隆与序列分析

二粒小麦（Triticum turgidum L．var．dicoccoides）具有极其丰富的遗传多样性,是栽培小麦品种改良的巨大基因库。在高分子量谷蛋白基因的组成上,它具有许多栽培小麦不存在的变异类型,在Glu—B1位点上的变异更大。我们利用种子贮藏蛋白的SDS—PAGE方法从原产于伊朗的二粒小麦材料PI94640中观察到缺失Glu—B1区的高分子量谷蛋白亚基。利用Glu-1Bx基因保守序列设计PCR引物,对该材料的总DNA扩增,获得了X型亚基编码基因（Glu-1Bxm）的全序列,其全长为3442bp含1070bp的启动子区。序列比较发现,Glu-1Bxm在启动子区序列与Glu—1Bx7的最为相似。而在基因编码区,我们发现Glu—1Bxm仅编码212个氨基酸,由于开放阅读框中起始密码子后第637位核苷酸发生了点突变,即编码谷酰胺的CAA突变为终止密码TAA,可能直接导致了该高分子量谷蛋白亚基的失活,这是我们在小麦Glu—B1位点基因沉默分子证据的首次报道。将Glu—1Bxm全序列与Glu—B1位点其他等位基因进行了系统树分析,发现Glu—1Bxm是较为古老的类型。本文还对该特异高分子量谷蛋白亚基变异类型对品质遗传改良研究的意义进行了讨论。     

黑麦基因组特异DNA片段的分离与SCAR标记的建立

以2个栽培黑麦、2个野生黑麦和4个普通小麦为材料,从200条10碱基RAPD随机引物中筛选出1条引物H11。H11在小麦中有1条低拷贝扩增,而在黑麦中却有极高拷贝的扩增。对H11在黑麦中的高拷贝片段进行克隆、测序,得其全长679 bp,记作OPH11679。根据OPH11679设计特异PCR引物H11-F和H11-R,对小麦族其它物种和含黑麦染色质的物种进行验证,结果发现仅含黑麦染色质的物种能扩增出长为643 bp的片段(命名为pScH643),这表明该片段为黑麦所特有。用H11-F和H11-R对1套中国春-Imperial黑麦附加系等进行扩增,结果显示pScH643片段分布在黑麦整套染色体上,这一结果在小麦-黑麦异源材料的分析中得到进一步验证。即表明pScH643片段可作为SCAR标记用于含黑麦染色质材料的检测。     

小麦叶锈病新抗源筛选

小麦叶锈病是小麦生产的主要病害之一,发病严重时往往导致大幅度减产。叶锈菌生理小种的变异易导致抗病基因抗性的丧失,因此不断获得新抗源对小麦抗病育种至关重要。小麦近缘植物中含有丰富的小麦育种所需的抗病基因。本研究从小麦-近缘植物双二倍体、附加系、代换系或易位系等创新种质中筛选出小麦叶锈病新抗源,为利用这些新抗源打下基础。苗期对116份供试材料人工接种美国堪萨斯州流行的小麦叶锈菌混合生理小种 (Lrcomp) ,其中部分材料人工接种09-9-1441-1等5个中国当前流行的叶锈菌生理小种进行抗性鉴定,筛选获得新抗源。116份种质中,31份免疫、近免疫或高抗Lrcomp。含有希尔斯山羊草、尾状山羊草、拟斯卑尔脱山羊草、两芒山羊草、卵穗山羊草、沙融山羊草、柱穗山羊草、顶芒山羊草、小伞山羊草、偏凸山羊草、中间偃麦草、茸毛偃麦草、长穗偃麦草、粗穗披碱草、栽培黑麦、非洲黑麦、提莫菲维染色质的部分种质免疫或高抗Lrcomp,而含二角山羊草、无芒山羊草、沙生冰草、多年生簇毛麦和一年生簇毛麦染色质的种质表现中感至高感Lrcomp。希尔斯山羊草4S染色体、尾状山羊草C#1和D#1染色体和两芒山羊草、顶芒山羊草中可能含有未被报道的抗Lrcomp的新基因,值得进一步向小麦转育。小麦-粗穗披碱草1HtS.1BL罗伯逊易位系对Lrcomp及 09-9-1441-1和09-9-1426-1等5个中国当前流行叶锈菌生理小种近免疫,值得利用染色体工程等方法获得小片段抗病易位系应用于我国小麦抗叶锈育种。     

小麦族中含St染色体组物种的特异分子标记的建立

以拟鹅观草(Pseudoroegneria spicata)、偏凸山羊草(Aegilops ventricosa)、二倍体簇毛麦(Dasypyrum villosum)、荆州黑麦(Secale cereale cv. Jingzhou rye)、普通小麦中国春(Chinese Spring)等15个物种为材料, 用200条10碱基随机引物进行RAPD分析, 筛选到拟鹅观草基因组中1个542 bp的特异DNA片段(GenBank登录号为DQ992032), 命名为OPH11542。根据OPH11542设计特异引物, 对小麦族物种进行PCR扩增, 发现拟鹅观草可以扩增出OPH11542以及分子量分别为742 bp (GenBank登录号为DQ992033, 记为OPH11742)和743 bp (GenBank登录号为EF014218, 记为OPH11743)的DNA片段, 而其他材料均未扩增出这3个片段。经序列比对结合多个软件的分析结果认为该3个片段为同一类新重复序列。利用特异引物对15份含St染色体的物种进行扩增, 发现含StY染色体组的物种均能扩增出OPH11742或OPH11743, 而含StH染色体组的物种均能扩增出OPH11542。这表明St染色体组在与其它染色体组组合形成多倍体的过程中往往会出现不同程度的重组或修饰。OPH11542、OPH11742和OPH11743可以作为检测St染色体的分子标记。     

用SON-PCR快速获得长鞭红景天CHS基因全长及其序列分析

采用单侧寡聚核苷酸嵌套PCR（SON—PCR）方法，从长鞭红景天中扩增得到查尔酮合成酶基因（chalcone synthase，CHS），命名为Rhchs，其序列全长为2443bp，包括682bp的启动子区、957bp的开放阅读框和3’UTR区。预测序列编码381个氨基酸，其氨基酸组成与其他已知的高等植物的查尔酮合成酶具有很高的同源性，与葡萄、山茶花、杜鹃和牵牛的同源性分别为87％、87％、86％和85％。且大部分氨基酸序列保守。序列分析表明，在启动子区域也找到了TATA—box、W—box、G—box like等顺式作用元件。     

叶绿体基因infA-rpl36区域在小麦族物种中的序列变异分析

利用小麦叶绿体基因组中infA-rpl36区域的序列设计引物, 对小麦族(Triticeae)的12个二倍体和多倍体的物种进行了PCR扩增和序列测定, 获得了长度为584～603 bp的12条DNA序列。序列分析表明, 供试物种在infA-rpl36基因间隔区的核苷酸变异明显高于基因编码区。基因编码区核苷酸序列同源性高达97%, 表明了目标片段具有高度的保守性。但在5个物种的infA编码区出现了较大的插入、缺失突变, 导致推导的氨基酸序列也发生了很大的变化, 证实了infA基因是叶绿体基因组中最活跃的基因之一, 而rpl36基因的变异较小, 说明不同叶绿体基因的进化速度是不同的。基于测定序列建立的种系树分析发现, 多倍体物种中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)具有多种不同的细胞质起源, 与核基因组一样在进化上较为复杂。     

手掌参内质网膜转运通道蛋白基因GcSec61β的克隆与表达

从高原耐寒珍稀植物手掌参(Gymnadenia conopsea)中克隆了一个编码107个氨基酸、长为621bp的全长cDNA序列。序列分析表明,它与真核生物内质网(ER)转运蛋白通道亚基Sec61β基因具有高度的相似性,命名为GcSec61β。进化分析的结果表明GcSec61β与拟南芥和水稻等Sec61β基因的遗传关系最近。经半定量RT-PCR检测得知,GcSec61β基因在手掌参幼芽和叶中均有表达,其表达量受低温诱导。GcSec61β基因的原核表达具有明显增加细菌耐低温特性。     

小麦新抗源CH5383抗条锈病基因的遗传分析及分子定位

CH5383是新育成的源于中间偃麦草的渗入系,对小麦条锈病和白粉病均表现免疫。为明确其抗性来源、遗传方式和抗病基因在染色体上的位置,将CH5383的系谱材料及其与高感条锈病品种(系)杂交的F1、F2和F2:3家系群体进行条锈病抗性鉴定。结果表明,CH5383对条锈病的抗性源于中间偃麦草,对条锈病生理小种CYR32的抗性由一对显性核基因控制,将此基因暂时命名为YrCH5383。从476对SSR引物中筛选到3对引物Xgwm108、Xbarc206和Xbarc77与抗病基因连锁,遗传距离分别是8.2 cM、10.7 cM和13.6 cM。根据这两对标记在染色体上的位置,将抗病基因定位到3B染色体的长臂上。3B染色体的长臂还未见有正式命名的抗条锈病基因的报道,推测YrCH5383可能是一个源于中间偃麦草的新抗条锈病基因。     

拟鹅观草St基因组ISSR特异标记的建立

以拟鹅观草(Pseudoroegneria spicata)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)、长穗偃麦草(Th.elonga-tum)、二倍体簇毛麦(Dasypyrum villosum)、澳冰草(Australopyrum retrofractum)等10份小麦族物种为材料,对100条ISSR引物进行分析,结果显示引物811可以在拟鹅观草(GenBank登录号为EU368859)和中间偃麦草中扩增出一条长441 bp的特异DNA片段命名为St441,而其它供试物种均未扩出.经序列比对、软件分析结合原位杂交结果认为St441为一类新的低拷贝重复序列.利用ISSR引物811对10份不同居群的中间偃麦草、20份披碱草属物种、4份小麦-偃麦草部分双二倍体、6份小麦-茸毛偃麦草后代和12份小麦对照进行扩增,结果发现除对照小麦外均能扩增出St441;进而对小麦-中间偃麦草两套附加系进行扩增,将St441初步定位于包括第四同源群在内的8条St染色体上.同时,发现只含有整条St染色体和St染色体片段的材料能扩增出St441,而仅有Js染色体的材料未扩增出St441.因此,该标记St441可以作为检测不同背景下St染色质的分子标记.