一种猪溶菌酶来源的抗菌六肽的分离鉴定及其性质

为提高猪溶菌酶(Sus scrofa lysozyme,SSL)的抗革兰氏阴性菌活性,将其进行了不同蛋白酶的水解,选择抗革兰氏阴性菌效果最好的水解产物,利用凝胶过滤色谱和反相制备色谱进行分离,对其功能成分进行液质联用鉴定。对分离得到的物质进行抗菌活性验证和生物信息学的分析,并在此基础上对抗菌物质的杀菌机理进行了探讨。结果表明,胰蛋白酶的水解产物具有较高的杀灭革兰氏阴性菌的活性,进一步分离纯化得到了具有抗革兰氏阴性菌活性的六肽A-W-V-A-W-K。经化学合成验证,该六肽既保留了SSL的部分抗菌活性,也具备杀灭多种革兰氏阴性菌的能力。进一步分析发现其位于SSL分子C端的一个螺旋-回环-螺旋的结构中,并由此推测其杀菌机理是通过改变细胞膜的渗透性,进而使细胞内溶物流出而造成细胞死亡,而抗菌实验也验证了这一推测。该抗菌肽的发现为后续提高SSL的抗菌活性提供了理论依据。     

融合表达HLH结构域对猪溶菌酶抗菌活性的影响

[目的]通过遗传操作提高猪溶菌酶抗革兰氏阴性菌的活性。[方法]对猪溶菌酶进行分子模拟,得到了包含功能肽的螺旋-回环-螺旋(HLH)结构域,将HLH编码基因与猪溶菌酶基因N端或C端进行融合,于大肠杆菌中诱导表达,经复性、纯化后检测其抗菌活性,并利用原子力显微镜和荧光染色对抗菌活性较高的融合蛋白杀菌机制进行初探。[结果]与对照组相比,N端和C端融合蛋白基本保持了猪溶菌酶对革兰氏阳性菌的活性;同时,两种融合蛋白对革兰氏阴性菌的抗菌活性均显著增强,其中N端融合产物活性更高,它对大肠杆菌ATCC 10798、大肠杆菌ATCC 25922、克雷伯氏菌TR5、铜绿假单胞菌ATCC 15442、沙门氏菌CMCC(B)50335的抗菌系数分别为1.64、1.24、2.56、1.72和1.42,最低抑菌浓度分别为90μg/mL、100μg/mL、40μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。经检测,该融合蛋白能显著增强革兰氏阴性菌细胞膜的通透性。[结论]通过融合表达自身来源的HLH结构域,猪溶菌酶抗革兰氏阴性菌活性得到了显著提升,可为其它溶菌酶抗菌活性的提高提供参考。     

黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】对黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶基因进行克隆和密码子优化,使其在毕赤酵母(Pichia pastoris X-33)中高效表达。【方法】以黑曲霉基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(Anfae A),并对Anfae A基因进行毕赤酵母密码子偏好性"随机优化"和"一对一优化",全基因合成后分别与表达载体pPICZαA连接,构建表达载体pPICZαA-Anfae A、pPICZαA-op Anfae A I和pPICZαA-op Anfae A II。经Sac I线性化后电转化至P.pastoris X-33中,筛选阳性转化子。摇瓶发酵4.5 d后,测定并比较重组阿魏酸酯酶(re Anfae A)酶活。【结果】密码子优化前阿魏酸酯酶酶活为6.8±0.1 U/m L,基因"一对一优化"和"随机优化"后的重组酶酶活分别为5.2±0.1 U/m L和39.9±0.1 U/m L,"随机优化"后酶活比优化前提高了近6倍,而"一对一优化"后酶活仅为优化前酶活的76.5%。重组阿魏酸酯酶的最适p H为5.5,且在pH 4.5-7.0稳定性较好;最适反应温度50°C,在45-50°C较稳定。【结论】阿魏酸酯酶基因经密码子"随机优化"后进行重组表达,酶活显著提高,对研究阿魏酸酯酶在毕赤酵母及其它宿主中的高效表达具有一定的借鉴意义,也为大规模工业化应用奠定了基础。