吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建

吸水链霉菌NND-52-C菌株是大环内酯类抗生素-阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术,将来自变铅青链霉菌TK24菌株的pU702质粒转化吸水链霉菌NND-52-C菌株的原生质体,建立了吸水链霉菌NND-52-C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND-52-C菌株原生质体制备和再生的条件,其原生质体形成率达到10^8／mL,再生率约为0．2％,转化率为10^2-10^3个转化子／μg质粒DNA。     

β-胡萝卜合成途径的不同启动子组合的比较研究

以耶氏解脂酵母菌(Yarrowialipolytica)MYA2613为底盘菌,表达来源于卷枝毛霉菌(Mucorcircinelloides)的基因car B,carRP后能有效生产β-胡萝卜素。启动子作为调控基因的重要顺式元件影响着基因的表达。为了优化基因GGS1,car B,carRP的表达强度组合,将上述3个基因、终止子与两组不同的启动子通过DNA assemble方法拼接后,得到了组合TEF1p-GGS1-xpr2t-GPD1pcar B-mig1t-EXP1p-carRP-lip2t和YAT1p-GGS1-xpr2t-GPD1p-car B-mig1t-FBAin1p-carRP-lip2t。经发酵表型验证,两株菌都产β-胡萝卜素,其中前者的产量是后者的4.18倍,具有明显优势。     

分支杆菌Mycobacterium fortuitum HCCB 003Δ1-脱氢酶的初步研究

研究了分支杆菌Mycobacterium fortuitum HCCB 003无细胞PBS抽提液对底物4AD和ADD的转化,发现该菌株中同时存在Δ1-脱氢酶和Δ1-还原酶,但前者的催化活性远高于后者.同时研究了不同温度及有关金属离子对Δ1-脱氢酶活力的影响,发现28℃为该酶的最适温度,以及一定浓度的Fe2+、Mn2+、Zn2+、和Ca2+对该酶具有激活作用.     

反义RNA介导的大肠杆菌非必需基因rpsF的基因沉默

【目的】探讨反义RNA技术介导的大肠杆菌非必需基因rpsF基因沉默导致菌体生长受抑制的原因。【方法】将rpsF基因5'端41-230 bp的片段反向插入带有末端配对结构的反义表达载体pHN678,获得重组质粒,导入大肠杆菌宿主获得反义RNA菌株Escherichia.coli/pHNF,并用诱导剂IPTG诱导反义RNA表达,通过与对照菌E.coli/pHN678的液体生长状态差异判断菌体生长表型;采用Real time RT-PCR方法跟踪分析转录水平。【结果】构建了针对rpsF的反义RNA菌株,且其生长受抑制程度与IPTG浓度呈正相关。IPTG浓度为100μmol/L时,菌体生长未受抑制,但靶基因rpsF的mRNA量降低了36%,而rpsR是位于同一操纵子下游的必需基因,其转录水平却未受影响;IPTG浓度为200μmol/L时,菌体生长明显受抑制,经分析发现rpsR转录水平降低了12%。【结论】反义RNA菌株E.coli/pHNF生长受抑制的原因是由于此反义RNA引起了同一操纵子下另一必需基因rpsR的转录水平降低。     

一株孕酮转化工程菌的构建

孕酮既是临床常用药物、又是可的松等药物的重要中间体,因此简便而快速的生产孕酮方法对于甾体激素的生产具有重要意义。本文利用红平红球菌的胆固醇氧化酶基因,构建了重组质粒BL21/p ET28b-cho E、并在大肠杆菌中获得重组表达。该菌株能够以孕烯醇酮为底物、转化生产孕酮。经条件优化,对浓度为0.2 g/L的孕烯醇酮的转化率大于80%。     

一株抗肿瘤活性的粗榧内生真菌的鉴定及其产物特性初步研究

利用传统分类学方法、电子显微镜观察、18S rDNA和ITS序列的测定以及系统发育分析对一株分离自粗榧抗肿瘤活性内生真菌HCCB1621进行分类鉴定,并对其产物抗肿瘤活性进行了初步研究．各种指标鉴定其为木霉属真菌绿色木霉（Trichoderma viride Pers．ex Fr）．该菌株经发酵培养120h,抗瘤活性达最强;活性在pH4～9范围内稳定：60℃处理1h,活性稳定,这些特性为活性产物的分离纯化和稳定性研究提供了必要的参考．     

新方法新技术与新型抗生素发现

日趋严峻的细菌耐药性问题给“抗生素传奇时代”带来了严重威胁, 传统的抗菌药物开发手段已很难应对, 因此急需新思路来寻找新型抗生素。近年来, 一些新方法新技术如新型筛选模型的构建、基因组挖掘技术以及组合生物合成等给天然产物的筛选引发了革命性的变革, 也为放线菌来源的新型抗生素的发现带来了新的希望。本文将对这些新技术及其在新型抗生素研发中的应用进展进行阐述。     

关注微生物来源的新药开发

自然界中微生物的多样性及其代谢产物的多样性,提供了发现新药(以及先导化合物)的不竭动力。随着生命科学的发展,尤其是随着分子生物学技术的发展和应用,使得以微生物为源泉的新药研发有了更多的支持,微生物药物的研究越来越受到国内外的重视。     

重组人GPx7的原核表达、纯化及其抗肿瘤活性检测

研究大肠杆菌表达重组人谷胱甘肽过氧化物酶7(glutathione peroxidase 7,GPx7),并对纯化精制的重组人GPx7进行体内抗肿瘤活性检测。以质粒pCDNA3.1(-)-GPx7为模板,PCR扩增获得N-端去除信号肽的GPx7基因片段,构建的重组质粒pET24A-GPx7在E.coli BL21(DE3)中诱导表达。采用Sulfopropyl强阳离子交换层析和Superdex 75分子排阻层析纯化精制获得原核表达的重组人GPx7蛋白。该蛋白的体外催化活性微弱,但S180荷瘤小鼠连续14d注射GPx7蛋白后,肿瘤生长受到抑制,抑制率为29.26%,与对照组相比具有显著差异。实验结果表明,采用阳离子交换和分子排阻层析两步法可纯化精制原核表达的重组人GPx,重组人GPx7蛋白在荷瘤小鼠模型中表现出体内抗肿瘤活性。     

马肝醇脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用RT-PCR技术从马肝扩增HLADH-E和HLADH-S基因,通过基因工程方法构建表达质粒pLY115E和pLY115S,在大肠杆菌中表达,并利用Ni柱分离纯化。利用紫外检测辅酶NADH在340nm的吸光值,来考察表达产物转化环己醇的活性。试验结果证明马肝醇脱氢酶HLADH-E和HLADH-S基因均能在大肠杆菌中表达,并且可溶性表达产物都具有氧化环己醇的活性,为马肝醇脱氢酶的进一步研究开发奠定了基础。