实时荧光定量PCR及其在微生物生态学中的应用

定量描述微生物群落的组成,在微生物生态学的许多研究领域都是非常重要的。然而由于可培养技术的局限性,定量描述微生物群落成为比较困难的事情。最近包括PCR技术在内的分子生物学技术为人们提供了有力的工具,使对微生物群落的分布、丰度等有了进一步的了解。实时荧光定量PCR技术作为核酸定量检测技术,自从发明以来在微生物生态学研究中逐渐得到了广泛的应用。从微生物生态学角度,综述了实时荧光定量PCR技术的原理、发展、优缺点及其在微生物生态学研究中的应用与研究进展,并探讨了实时荧光定量PCR技术的发展和应用前景。     

全氟辛烷磺酰基化合物对剑尾鱼肝脏抗氧化物酶活性的影响

目的研究全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)暴露对剑尾鱼(Xiphophorus helleri Heckel)抗氧化物酶活性的影响,探讨PFOS对鱼类的致毒机理。方法使用浸润法以3.5、7.0、14.0和28.0 mg/L四个PFOS浓度为剑尾鱼染毒,定量测定了96 h内肝脏组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)含量的变化。结果 PFOS暴露12 h后,除28.0 mg/L组SOD活性被显著性抑制外,其余各组与对照组均无显著性差异(P>0.05);7.0 mg/L组和14.0 mg/L组在24 h被极显著诱导(P<0.01),并且一直保持至96 h。CAT活性随PFOS浓度的升高而降低,12 h时,除3.5 mg/L组外,其余各组CAT活性被显著或极显著抑制,至24 h时,各组CAT活性有上升趋势,但48 h后,各组呈不断下降趋势持续至96 h,其CAT活性恢复到12 h水平。GSH-PX活性变化与CAT活性变化趋势相似,其中28.0 mg/L组在不同时间均被显著性抑制,并在96 h时抑制率达到最高值64.8%。MDA含量在12 h时呈小幅下降趋势,但随着暴露时间的延长,各处理组MDA含量呈连续上升趋势,并在96 h时达到最高点,诱导率分别为71.2%、70.1%和85.1%。结论结果表明,SOD的高活性是由于机体中超氧阴离子的存在,而高浓度的超氧阴离子能够灭活CAT和GSH-PX活性,因此,CAT和GSH-PX活性始终低于对照组。GSH-PX对PFOS的敏感性高于CAT。MDA含量持续升高反映出细胞组织已经遭受到氧化损伤。剑尾鱼活体的实验表明,PFOS能够诱导肝脏氧化应激反应,氧化损伤是PFOS致毒的主要途径之一。     

灌溉方法与施氮对土壤水分、硝态氮和小麦生长发育的调控效应

为探明玉米秸秆还田下小麦的合理灌溉与施肥方法,于田间研究了漫灌(FI)、微喷灌(SI)、滴灌(DI)和灌水施氮模式(N₁, 基施纯N 157.5 kg·hm^-2+拔节期施纯N 67.5 kg·hm^-2; N₂, 基施纯N 157.5 kg·hm^-2+拔节期施纯N 45.0 kg·hm^-2+灌浆期施N 22.5 kg·hm^-2)对土壤水分、硝态氮(NO₃^--N)含量和小麦生长发育的影响.结果表明: 灌溉方法和灌水施氮模式共同影响土壤含水量和贮水量的变化.其中,灌溉方法对越冬期和返青期0～60 cm、孕穗期和灌浆期0～160 cm、成熟期100～160 cm土层含水量影响相对较小,对越冬期和返青期80～160 cm、成熟期0～80 cm土层含水量影响大;FI对含水量和贮水量影响最大,DI次之,SI最小;SI和DI的灌水施氮模式中灌水量多,则土层含水量高、贮水量多,变化大.NO₃^--N含量受灌溉方法和施氮的影响,施氮对0～20 cm土层影响大,SI生育期NO₃^--N含量变化大,DI越冬期至孕穗期NO₃^--N含量变化小,此后变化大,FI与DI相反;生育前中期灌水量对NO₃^--N含量影响大,后期施氮对NO₃^--N含量影响大;SI和DI的2种灌水施氮模式中冬前灌水量多的NO₃^--N含量变化大.灌溉方法中SI越冬期总茎数和单株分蘖高,成穗率高,成穗数多,产量、水分利用效率(WUE)和氮素利用效率最高,滴灌次之,漫灌最低;SI和DI中N₁生育期总茎数、成穗数多,但穗粒数和千粒重低,产量、WUE和氮素利用效率低于N₂.因此,玉米秸秆还田后播种小麦,微喷灌代替漫灌生育期灌4水,施足基肥,拔节期和灌浆期分次追氮,是山西南部小麦-玉米一年两熟区小麦节水高产高效栽培模式.     

Txnip基因siRNA慢病毒表达质粒构建及促进猪前体脂肪细胞分化

硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein, Txnip)是一种氧化还原调节蛋白质,与硫氧还蛋白结合并抑制其活性,调节细胞氧化还原状态,影响细胞多种生理过程,然而其在猪脂肪细胞分化中的作用尚不明确。本文设计合成3对靶向猪Txnip基因的shRNA寡核苷酸,分别连接于重组慢病毒载体pGLV_3/H_1/GFP+Puro构建siRNA表达质粒。测序验证后,与包装质粒共转染293T细胞,获得滴度1×10~8 pfu/mL的慢病毒干扰质粒。以MOI值100转染原代培养猪前体脂肪细胞,转染率均达80%以上,其中Txnip-shRNA-2转染细胞Txnip基因沉默率达75%。转染Txnip-shRNA-2的猪前体脂肪细胞用成脂分化培养液诱导后,每隔1 d检测细胞成脂分化及相关基因表达。结果发现,其分化比阴性对照质粒转染或未转染细胞显著增强(P<0.05),PPARγ和FAS mRNA表达水平显著提高(P<0.05)。本文构建siRNA慢病毒表达质粒能有效干扰猪Txnip基因表达,Txnip表达沉默可通过上调PPARγ表达促进猪前体脂肪细胞分化。本研究提示,Txnip可能是猪脂肪细胞分化的抑制因子。     

内固定与关节置换手术治疗骨质疏松性髋部骨折的临床效果及术后并发症的影响因素分析

目的:分析内固定与关节置换手术治疗骨质疏松性髋部骨折的临床效果及其术后并发症的影响因素。方法:将2017年4月至2018年5月因骨质疏松性髋部骨折于我院进行手术治疗的78例患者作为研究对象,参考患者自身意愿按照采取手术方案的不同将所有患者分为内固定组与关节置换组。内固定组主要采用动力髋螺钉内固定治疗;关节置换组采用全髋关节置换术治疗。对比分析两组治疗后并发症的发生情况及关节功能恢复程度。结果:关节置换组手术治疗后关节功能的恢复情况显著优于内固定组(P0.05),术后并发症发生率低于内固定组(P0.05);患者术后并发症发生的主要影响因素包括:术前存在合并症、手术时机≥2h、采用内固定手术。结论:与内固定术相比,关节置换手术治疗骨质疏松性髋部骨折患者的疗效和安全性均更高,但采用该手术治疗时需注意手术操作的规范性及手术时机。     

新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用北大核心CSCD

基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4μmol/L Mpro与5μmol/L底物建立了Z′因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。     

不同地区麦冬遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对5个地区6个麦冬居群进行遗传多样性分析。选用10条扩增带型清晰且重复性好的引物进行扩增,共获得115条带,其中89条具有多态性,多态性比例为77.39%。当遗传相似系数(GS)为0.61时,可将6个麦冬居群分为2大类群。居群的GS平均值为0.643,表明供试居群之间存在较近的亲缘关系,且地域越近的其亲缘关系关系越近。研究表明ISSR分子标记技术能够很好地用于不同地域同种物种的亲缘关系分析。     

超声引导下经皮穿刺置管引流治疗重症急性胰腺炎急性胰周液体积聚的临床疗效

目的:探讨超声引导下经皮穿刺置管引流(PCD)治疗重症急性胰腺炎(SAP)急性胰周液体积聚的的临床疗效。方法:收集2009年3月~2013年10月我院收治的经临床确定的SAP急性胰周液体积聚患者51例,按随机数字表法分为观察组(26例)和对照组(25例),观察组患者给予超声引导下经皮穿刺置管引流术治疗,对照组采用剖腹引流的经典引流。比较两组患者血淀粉酶恢复至时间、住院时间、治愈率、并发症发生率。结果:观察组血淀粉酶恢复时间及住院时间均小于对照,差异有统计学意义(P0.05);观察组患者总有效率位96.2%(25/26),高于对照组的68.0%(17/25),两组比较组间差异有统计学意义(P0.05);观察组治疗后病死、腹腔出血、胰瘘发生率高于对照组(均P0.05);两组脓毒症及多器官功能障碍综合症(MODS)的比较差异无统计学差异(P0.05)结论:超声引导下经皮穿刺置管引流术治疗SAP急性胰周液体积聚效果良好,并发症的低,安全可靠,具有较大的临床推广价值。     

金黄色葡萄球菌isdb基因的克隆表达及其小鼠免疫试验

为了研究金黄色葡萄球菌表面Isdb蛋白的免疫原性,应用PCR方法扩增出金黄色葡萄球菌Wood46株的isdb 基因并进行序列分析,再将isdb 基因插入到pET32-a(+) 载体上,构建了pET32-a(+)-isdb重组质粒,将重组质粒转化到宿主菌大肠埃希菌BL21中并诱导表达和纯化Isdb蛋白。用纯化的Isdb蛋白免疫小鼠,检测小鼠血清中抗体水平;在二次免疫之后的第2周,用金黄色葡萄球菌Wood46、HLJ23-1株对小鼠攻毒,每组8只小鼠。研究结果发现：isdb基因在不同菌株中高度保守;Isdb蛋     

气候变化对不同水分条件下柿幼树光合作用的影响

以两年生柿树为试材,研究了高浓度CO₂处理（700 μmol·mol^-1）、高温处理（日平均温度高于正常日平均温度约5 ℃）、高温和高浓度CO₂复合处理及对照（温度为外界环境温度,CO₂浓度380 μmol·mol^-1）对不同水分条件下柿树净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)、水分利用效率(WUE)、叶绿素含量和叶绿素荧光参数F_v/F_m、F_v/F_o的影响.结果表明:高温和高浓度CO₂复合处理使处于各水分条件下的柿树T_r、G_s减小,WUE增大;在高、中水分条件(分别为田间持水量的75%～85%和55%～65%)下高温和高浓度CO₂复合处理使柿树P_n增大,在低水分条件(为田间持水量的35%～45%)下使柿树P_n减小.高浓度CO₂处理使处于各水分条件下的柿树P_n、WUE增大,G_s、T减小.高温及高温和高浓度CO₂复合处理下WUE均受土壤水分状况的影响,并随土壤含水量的升高而升高.与对照相比,高浓度CO₂处理还提高了各水分条件下植株叶片水平的水分利用效率、叶绿素a、叶绿素b、叶绿素（a+b）、类胡萝卜素含量及F_v/F_m和F_v/F_o,缓解了水分胁迫,提高了柿树的抗逆能力.