基于核酸适配体的生物分析新方法研究进展

核酸适配体是从随机文库中采用SELEX技术筛选所得的单链短链寡核苷酸片段(通常为15-80个ss DNA或ss RNA)。其能够折叠形成独特稳定的三维结构,通过静电相互作用,氢键,范德华力,碱堆叠或多种作用力组合特异性地与多种靶标结合。适配体因具有构象变化能力而被用作生物分析中的理想识别配体。目前,基于适配体的生物分析新方法得到广泛研究,并用于蛋白多肽类药物分析、疾病标志物诊断、外泌体检测、循环肿瘤细胞检测和病毒检测等方面。本文综述了核酸适配体用于生物分析方法开发的最新进展,比较和讨论不同分析方法,并对基于适配体的生物分析新方法提出了设想和展望,为开发新的生物分析方法和检测技术提供了思路和借鉴。     

基于线粒体COI和16S片段序列的北部湾北部水螅水母DNA条形码分析

水螅水母类是浮游动物群落的重要组成部分,在近岸海洋生态系统物质循环和能量流动中扮演着重要角色。水螅水母类形态结构简单,但其物种的准确鉴定一直是分类工作中的难点。DNA条形码极大地促进了水螅水母物种的快速、准确鉴定。本研究扩增了北部湾北部28种水螅水母的线粒体COI和16S序列,分别为92条和116条;比较了2个基因片段的种内、种间K2P(Kimura 2-parameter)遗传距离;构建了基于这2个基因片段的系统发育邻接树(neighbor-joining phylogenetic tree);并结合矢量分析构建了Klee-diagram图。结果显示:COI序列的种内遗传距离为0.008±0.005(0–0.033),种间遗传距离为0.298±0.128(0.092–0.597);16S序列的种内遗传距离为0.006±0.010(0–0.047),种间遗传距离为0.394±0.195(0.068–0.898)。2个基因序列在所调查种类中,种内遗传差异均小于种间遗传差异,存在明显的条形码间隔(barcoding gap)。基于2个基因片段的NJ树均显示,单种所有个体都位于同一独立分枝。研究结果表明,以COI和16S作为DNA条形码均能对北部湾北部常见水螅水母类进行物种鉴定。     

一株高效降解木糖的耐酸、嗜热厌氧杆菌的生理特性及产物分析

【目的】分离高效降解木糖的嗜热厌氧杆菌菌株,用于发酵生产生物燃料乙醇,为后继的构建基因工程菌株及联合生物工艺提供材料。【方法】运用亨盖特厌氧操作技术从胜利油田油层采出液两年的富集样中分离到一株嗜热厌氧杆菌xyl-d。采用形态学观察、生理生化指标鉴定及基于16S rRNA的系统发育学分析确定其分类地位。【结果】菌株xyl-d为革兰氏阴性厌氧杆菌,菌体大小为(1.35-5.08)μm×(0.27-0.40)μm,单生、成对或成簇生长,芽胞圆形,端生。温度生长范围30-85℃(最适温度65℃);pH范围3.0-10.0(最适pH 7.5);NaCl浓度范围0%-4%(最适NaCl浓度2.0%)。发酵D-木糖的产物是乙醇、乙酸、CO2及少量的异丁醇、丙酸。菌株xyl-d的(G+C)mol%含量为45.6%,与热厌氧杆菌属模式菌株威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)DSM10319T及嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)DSM2246T的16S rRNA序列相似性均为99.3%。菌株利用D-木糖产乙醇的最佳初始pH为8.5;少量酵母粉能刺激生长并显著提高发酵D-木糖的产醇率,使乙醇成为主要的发酵产物;培养基中乙醇浓度达到7%(V/V)时菌体生长受到抑制,最佳生长条件下D-木糖的降解率可达91.37%,最佳产醇条件下发酵1摩尔D-木糖可产生1.29摩尔的乙醇。【结论】菌株xyl-d是从特殊生境(油藏)中分离到的一株高效降解D-木糖的耐酸、嗜热的厌氧杆菌,其为半纤维素降解产乙醇的联合生物工艺提供了菌源。     

辣根过氧化物酶的热稳定剂

保持酶的天然状态和高催化特性具有重要的意义。本研究筛选了辣根过氧化物酶(HRP)的稳定剂并研究了其作用机制。结果发现硫酸镁和明胶能够显著提高HRP的热稳定性,并且两者具有协同作用。在硫酸镁和明胶组成的酶稳定剂存在的条件下,HRP在50oC保温80h后仍能保持89%的活性,常温下存放90d后可保持57%的活性,而未加稳定剂的对照样品中HRP的残留活性分别为6%和小于1%。通过对HRP的Soret带吸收光谱,色氨酸内源荧光,ANS荧光进行分析,揭示酶稳定剂可以明显降低在加热条件下HRP的变性程度,从而维持较为稳定的天然构象。     

高产中性蛋白酶菌株的筛选、优化及中试放大

为筛选分离得到具有高产中性蛋白酶能力的菌株,同时研究菌株的发酵条件,在牛粪、猪粪堆肥时期采集样品,在以干酪素为唯一碳源的固体培养基上筛选分离得到19株产蛋白酶菌株。选取其中1株产酶效果最好的菌株PC2,其水解圈D/d值为4.25,酶活为10.74 U·mL^-1。结合形态学、生理生化以及16S rDNA分子生物学鉴定结果,认定其为枯草芽孢杆菌,革兰氏阳性菌。进一步对其进行摇瓶和中试放大条件优化,LB培养基37 ℃活化24 h,干酪素发酵培养基30 ℃发酵48 h,转速为180 r·min^-1。中试放大具体参数：50 L种子罐180~240 r·min^-1,通气量20~30 L·min^-1。500 L发酵罐：添加1%小麦蛋白粉,100~180 r·min^-1,通气量10~25 L·min^-1。发酵结束活菌含量44.58亿·mL^-1,酶活29.48 U·mL^-1,是初始值的2.745倍。研究结果可为探究含中性蛋白酶菌株的微生物菌剂奠定理论基础,并指导工业化菌剂的生产。     

五株纤毛虫遗传关系的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术,尝试对四种五株纤毛虫(褶累枝虫(Epistylis plicatilis)、绿草履虫(Paramecium bursaria)、多态喇叭虫(Stentor polymorphus)、嗜热四膜虫BF1株(Tetrahymena thermophilaBF1)和嗜热四膜虫BF5株(T.ther-mophilaBF5))进行遗传关系研究。用13个ISSR引物对五株纤毛虫进行扩增,六个ISSR引物获得多态片段。根据Nei s遗传距离矩阵构建了五株纤毛虫的遗传关系树状图。UPGMA,NJ聚类图表明:两株嗜热四膜虫最先聚在一起;其次是褶累枝虫和多态喇叭虫聚在一起,然后再与嗜热四膜虫聚在一起;咽膜亚纲的绿草履虫形成独立的一枝。结果显示:①缘毛亚纲纤毛虫可能是寡膜纲中较独特的一个类群,建议提升缘毛亚纲纤毛虫的分类地位;②缘毛亚纲褶累枝虫与膜口亚纲嗜热四膜虫的亲缘关系近于咽膜亚纲绿草履虫,在寡膜纲中绿草履虫处于原始地位;③五株纤毛虫基因组中均含有微卫星DNA序列:(GTG)4(、GACA)4(、AG)8(、CAA)6和(GAA)6。     

典型亚热带热分层水库秋季细菌群落垂直分布

水库在我国东南沿海地区是重要的饮用水水源地,对地区经济发展和社会稳定起到重要作用。选择亚热带地区典型的热分层水库——福建莆田东圳水库,于2011年秋季稳定分层期,以水体温度的垂直变化特征为依据进行分层采样。应用PCRDGGE和克隆测序的方法研究浮游细菌群落的垂直分布特征,利用多元统计分析揭示细菌群落与热分层水体理化指标之间的关系。结果显示:溶解氧、电导率、叶绿素a、总氮、氨氮及硝氮在上下层水体中的分布有显著差异,下层缺氧区细菌的ShannonWiener指数和DGGE条带数明显高于上层好氧区,表明东圳水库热分层水体中存在明显的物理、化学及生物分层现象。测序结果表明β-变形菌可能是东圳水库中占优势的细菌类群,统计结果提示溶解氧是显著影响细菌群落组成的环境因子。热分层水体的物理化学分层与水体细菌群落结构密切相关,提示水库生态学研究应对水体热分层给予重视。     

生物信息学分析筛选结直肠癌靶基因及评估预后价值

为寻找与结直肠癌发展和预后相关的潜在关键基因及信号通路。从美国国立信息中心NCBI的GEO数据库获得结直肠癌基因表达数据集GSE106582,通过PCA对样本进行分组,利用GEO2R进行综合分析,筛选结直肠癌与癌旁对照组的差异表达基因;通过DAVID在线工具对差异表达基因进行GO本体分析和KEGG通路富集分析,初步分析差异表达基因的生物学作用;基于STRING数据库对差异表达基因进行蛋白质相互作用网络分析,利用Cytoscape软件进行可视化并筛选关键基因;用生存分析和ROC曲线诊断对关键基因进行鉴定并通过数据集GSE21510进行验证。共鉴定出199个差异表达基因,其中53个为上调基因,146个为下调基因;上调的差异表达基因主要富集在与胶原蛋白分解代谢过程、细胞外基质分解、细胞外基质受体相互作用和PI3K/AKT信号通路等生物学过程;下调的差异表达基因主要富集在碳酸氢盐运输、一碳代谢过程、矿物质吸收、药物代谢-细胞色素P450和氮代谢通路等生物学过程;MCODE分析、生存分析和ROC诊断共发现3个基因分别为BGN、COL1A2和TIMP1可能与结直肠癌的发生发展有关,它们在肿瘤组织中的异常高表达与患者较差的生存期呈正相关,GSE21510的验证结果与GSE106582的分析结果相同。本研究采用生物信息学方法对CRC基因芯片数据进行挖掘,从基因水平探讨CRC潜在的发病机制、肿瘤标志物的及患者预后分子的筛选,以及可能的药物治疗靶点提供了一定的参考价值和理论基础。     

血管内皮功能与急性脑梗死患者梗死类型及颈动脉斑块性质的相关性

目的:研究急性脑梗死(ACI)患者血管内皮功能的变化情况,并分析其与脑梗死类型及颈动脉斑块性质的相关性。方法:选择2014年6月到2015年6月在我院收治的脑梗死患者100例作为研究对象。根据病史及磁共振成像(MRI)诊断结果分为ACI组(n=70)和非急性脑梗死(NACI)组(n=30),对两组患者间的血管内皮细胞功能的相关指标进行比较,同时按照梗死类型以及颈动脉斑块性质不同对ACI组进行分组,探究梗死类型与斑块性质与反应性充血指数(RHI)的相关性。结果:ACI组纤维蛋白原(Fbg)、低密度脂蛋白(LDL)、大内皮素-1(big ET-1)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)和内皮细胞生长因子(VEGF)水平均高于NACI组,RHI水平低于NACI组,差异有统计学意义(P0.05)。不同急性脑梗死TOAST分型中心源性栓塞型(CE)、小血管闭塞或腔隙性梗死型(SAA)、不明原因型(SUE)和大动脉粥样硬化型(LAA)测得RHI水平逐渐上升,hs-CRP水平和big ET-1水平逐渐下降,差异具有统计学意义(P0.05);比较不同斑块性质发现无斑块组、硬斑块组、软斑块组和混合斑块组的VEGF水平逐渐升高,RHI水平逐渐降低,差异均有统计学意义(P0.05)。相关性分析显示,RHI与斑块性质、hs-CRP以及big ET-1之间呈现负相关(r=-0.672,-0.402,-0.512,P0.05)。结论:血管内皮功能与急性脑梗死类型和颈动脉斑块性质有相关性,可作为评估梗死类型和斑块性质的预测指标。     

褪黑素对盐胁迫下普通菜豆芽期核酸修复的调控机制

普通菜豆(Phaseolus vulgaris)是重要的食用豆作物, 然而其极易受盐胁迫危害, 导致产量下降。褪黑素能提高植物耐盐能力。为探明外源褪黑素调控普通菜豆耐盐能力的机制, 以普通菜豆品种奶花芸豆(GZ-YD014)为实验材料, 设置水(W, 对照)、盐胁迫(S)和盐胁迫+100 µmol∙L^-1褪黑素(M+S) 3个处理。结果发现, 盐胁迫抑制了普通菜豆胚根的生长, 使其长度、表面积、体积以及直径显著降低, 外源褪黑素可缓解盐胁迫对普通菜豆胚根生长的抑制。外施褪黑素显著降低盐胁迫下活性氧积累和丙二醛(MDA)含量, 提高保护酶(过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及抗坏血酸过氧化物酶)活性, 增加渗透调节物质(可溶性糖和可溶性蛋白)以及生长素(IAA)、赤霉素(GA)和玉米素(ZT)的含量, 降低脱落酸(ABA)含量。通过转录组分析挖掘出217个差异表达基因(DEGs), DEGs在GO富集中显著(P-value<0.05)富集到核酸相关条目上, 在KEGG富集中显著(P-value<0.05)富集到核酸损伤修复(包括碱基切除修复、错配修复以及核苷酸切除修复)通路。qRT-PCR以及RAPD分析结果表明, 核酸损伤修复通路为外源褪黑素调控普通菜豆耐盐能力的一种机制。该研究揭示了外源褪黑素对普通菜豆芽期耐盐能力的调控机制, 可为褪黑素应用于盐胁迫下普通菜豆增产提供理论依据。