豆豉纤溶酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化(英文)

豆豉纤溶酶是从豆豉中发现的新型纤溶酶.从枯草杆菌DC-12中提取总DNA,PCR法扩增pro-DFE基因.将pro-DFE基因插入载体pET-32a,构建表达质粒pET-pro-DFE,转化大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株进行变温诱导表达,重组菌株于37℃培养至OD600为0.6时,加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG于24℃进行诱导,SDS-PAGE显示可溶性重组融合蛋白约占重组蛋白的60%.且少量融合重组蛋白发生自切割,形成成熟的豆豉纤溶酶,破菌上清中含有成熟的豆豉溶栓酶,纤溶活性为200IU/mL.重组酶经纯化后比酶活为1280IU/mg.     

不同成熟度树葡萄叶片中类黄酮合成转录组基因分析

为了解树葡萄(Myrciaria cauliflora)类黄酮合成相关酶差异表达基因信息,对其幼叶和成熟叶进行全转录组测序并比较分析。结果表明,从树葡萄幼叶和成熟叶中获得59 321条单基因簇(Unigenes),在8大数据库共注释到32 912条Unigenes信息,其中类黄酮合成代谢相关酶基因77个,在成熟叶片中显著下调表达的基因6个,包括2个CHI、1个CHS、1个F3H、1个2-羟基异黄酮脱水酶基因和1个ANS。5个差异表达基因经qRT-PCR验证的结果与转录组测序结果相符合。因此,树葡萄叶片中含有大量不同种类黄酮合成代谢相关酶家族基因,成熟叶片中类黄酮含量显著减少是由于少量相关基因显著下调。     

利用α凝集素在毕赤酵母表面展示脂肪酶

目的:将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)通过α凝集素3’末端功能区域展示在毕赤酵母表面。方法:采用PCR方法扩增得到CALB成熟肽编码基因,将其连接到α凝集素3’末端的上游再与穿梭载体pPIC9K连接,构建表面展示载体p KNS-CALB。检测其水解活力和相关酶学性质。结果:展示CALB的毕赤酵母在甲醇的诱导下,表现出水解活性,最高可达382 U/g干细胞。对展示CALB的酶学性质研究表明:其最适温度为45℃,最适pH为8.0,60℃水浴4 h后残留酶活力高于最大酶活力的50%,其水解对硝基苯酚丁酸酯的酶活力最高。结论:利用α凝集素成功将CALB展示于毕赤酵母表面,酶活力有较大提高。     

黄秋葵花和果荚转录组测序及类黄酮代谢差异表达分析

采用Illumina Hi seq 2500转录组高通量测序,构建黄秋葵花和果荚转录组文库,并利用测序评估、差异基因功能注释等生物信息学方法进行分析。研究结果表明：(1)分别获得黄秋葵花和果荚有效数据7.12 Gb和8.14 Gb,碱基百分比(Q30)均达到91.0%以上。(2)获得差异表达基因(DEGs)1 336个,其中上调基因319个,下调基因1 017个。(3)获得功能注释的基因有1 131个,GO将455注释基因归成41个功能小类,主要涉及代谢过程、催化活性、单一生物过程和细胞过程等过程;KOG注释了472个DEGs,涉及23个功能分类,其中与次生代谢直接相关过程O和Q类别获得111个注释结果;KEGG将372个DEGs注释到80条代谢通路中,获得F3H、F3′5′H、DFR、ANR、ANS、GT、LAR共10个关键差异基因,其中F3H、DFR在黄秋葵花中表现上调效应,F3′5′H、ANR、LAR在黄秋葵果荚中表现显著上调效应,ANS、GT则分别在花和果荚中均有上调或下调效应。(4)实时定量PCR分析显示,其中7个差异表达基因得到的相对表达量与转录组表达谱分析趋势完全一致。(5)类黄酮代谢途径分析表明,黄秋葵花通过F3H、DFR、ANS、GT途径将NAR催化为生成花青素苷;果荚则将NAR通过F3′5′H将催化为DHM,后在FLS催化下生成黄酮醇类物质等;部分NAR在F3H、 DFR催化下,生成无色飞燕草素苷元,再分别在ANS、LAR作用下,进入花青素苷元和原花青素合成途径。该研究结果丰富了黄秋葵转录组信息,为黄秋葵类黄酮物质纯化和功能利用提供参考依据。     

大孔树脂纯化嘉宝果叶片多酚及其生物活性和组成分析

为探讨嘉宝果(Myrciaria cauliflora)叶片多酚的分离纯化方法,对4种树脂(NKA-2、NKA-9、HPD-826和HPD-400A)进行了筛选,并分析了其多酚的抗氧化、体外降糖活性和组成成分。结果表明,NKA-9树脂适于嘉宝果叶片多酚纯化,最佳工艺条件为:上样液质量浓度2.00 mg/mL、洗脱液乙醇体积分数70%、上样流速1.0 mL/min、上样量204 mL、洗脱流速0.9 mL/min、洗脱量70 mL。嘉宝果叶多酚纯度可达69.86%。嘉宝果叶片纯化后的多酚抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性高于纯化前,但α-淀粉酶抑制活性低于纯化前。HPLC结果表明,嘉宝果叶片中含有杨梅苷、芦丁、金丝桃苷和鞣花酸,其中鞣花酸含量最高[(16.15±0.49) mg/g]。因此,NKA-9树脂适合分离纯化嘉宝果叶片多酚,纯化后的多酚抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性增强。     

紫背天葵叶片中花青素种类及合成调控基因转录组分析

为获取紫背天葵(Cynura bicolor DC.)叶片中花青素种类及其合成调控基因等信息,该试验以紫背天葵叶背面紫色以及经处理叶背面几乎全绿(对照)的叶片为材料,进行转录组测序分析,同时进行6个相关差异表达基因的qRT-PCR分析和6种花青素苷元的HPLC检测,以揭示紫背天葵特有的花青素苷元及其合成调控关键基因信息。结果表明:(1)在紫背天葵中共获得14个花青素苷元及32个花青素合成调控基因信息,其中表达量差异显著下调的4个基因为Pg(c11692)、Cy(c42112)、ANS(c38551)和3GT(c9064),表达量差异显著上调的2个基因是D FR(c35961)和3GT(c20283)。(2)qRT-PCR检测结果显示,上述6个基因在2种紫背天葵叶中的表达趋势(上调或下调)与转录组测序结果完全一致,但转录组测序检测到的表达趋势差异倍数比qRT-PCR检测结果更加明显。(3)HPLC分析显示,紫背天葵叶中均未检测到Dp、Pt、Pn及Mv等4类花青素苷元,但紫背天葵叶中富含Cy花青素苷元,且背面紫色的叶中Cy类花青素苷元含量(62.21 mg/kg)显著高于绿色叶对照(6.86 mg/kg);背面紫色和全绿叶中的Pg花青素苷元含量均低于0.43 mg/kg。研究推测,Cy和Pg花青素苷元在绿叶紫背天葵(对照)中含量显著降低可能是因为存在1个ANS和1个3GT正调控以及1个DFR和1个3GT负调控所致。     

RAPD及SRAP两种分子标记技术对苦瓜杂交种纯度的鉴定分析

以F1代苦瓜杂交种如玉11号及其亲本为材料,利用RAPD及SRAP两种分子标记技术对这3种苦瓜基因组DNA进行比较分析,以获得该杂交种及其亲本（或母本）差异目的基因片段。经过多次对该3种苦瓜叶片DNA提取,PCR扩增及其PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析,在供试的46个RAPD引物及121对SRAP引物中,筛选出1个RAPD引物及1对SRAP引物能区分该苦瓜杂交种及其母本种子,通过进一步验证分析,证明该两种分子标记的特异引物可作为如玉11号苦瓜杂交种子的纯度鉴定之用。     

紫背天葵叶和花中花青素合成相关转录组基因分析

为获取紫背天葵(Gynura bicolor D C.)花青素合成代谢相关调控基因信息,该试验以紫背天葵叶片为材料,以其花朵为对照,进行转录组测序,并进行CHS、CHI、F3H等8类合成酶基因以及MYB、bHLH及WD40等3类转录因子检索,从中选取8个相关差异表达显著调控基因进行qRT-PCR验证分析。结果显示:(1)在紫背天葵中共获得72个花青素合成酶信息,其中差异表达明显的有1个F3′H和2个3GT下调,9个F3H基因中有上调基因4个和下调基因5个。(2)在紫背天葵中获取到238个MYB、113个bHLH和219个WD40转录因子,这3类转录因子中差异表达明显的分别为22个、16个和7个。(3)qRT-PCR结果显示,所选取的8个花青素合成相关调控基因,在紫背天葵叶及花朵中的下调表达趋势与转录组测序结果完全一致,但不同基因差异表达趋势略有不同。研究表明,在紫背天葵叶片和花朵中所存在的大量花青素合成代谢调控基因中,只有少量差异表达显著,但转录因子相比合成酶的调控更为复杂。     

遮阴对柠檬香茅中萜类化合物及其合成酶基因影响研究

为获取柠檬香茅(Cymbopogon citratus)中萜类化合物及其合成酶基因信息,以正常生长及遮阴下的柠檬香茅嫩叶为材料,进行代谢组学和转录组学结合q RT-PCR验证分析。代谢组分析结果表明,柠檬香茅所含萜类共23种,包括单萜4种、倍半萜4种、二萜8种、三萜3种和四萜4种。在遮阴下,柠檬香茅的二萜类银杏内酯C和四萜类虾青素相对含量更高。转录组测序结果表明,单萜生物合成涉及4类合成酶的24个基因,二萜生物合成涉及11类合成酶的49个基因,倍半萜和三萜生物合成涉及12类合成酶的58个基因,其中6类合成酶的8个基因在遮阴下的相对表达量显著提高,而前萘二烯加氧酶(c64786.0)基因正好相反。q RT-PCR分析表明,遮阴下4个FPKM值差异明显的萜类合成酶基因表达的变化趋势与转录组测序结果一致,但不同合成酶基因的差异表达量存在差异。因此,柠檬香茅所含4类共23种萜类化合物由27类合成酶共131个基因编码而来,不同光照强度影响9个合成酶基因的表达和2种萜类化合物含量。