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1.
【背景】禽β防御素6是禽体内分泌的一类抗菌肽,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用,但其常规表达方式效率较低,难以在产业化生产中加以应用。【目的】建立稳定表达AvBD6的细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性,为其他防御素表达提供参考。【方法】利用显微镜观察构建真核重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6转染至293T细胞后的转染效率;收集293T细胞上清液并感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素加压筛选稳定表达株;利用RT-PCR和Western Blot分别检测目的基因在转录水平和蛋白水平的表达情况;利用扫描电镜观察细胞培养上清液对耐药大肠杆菌的抗菌效果及其对菌体的损伤。【结果】成功构建重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6,筛选出稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,而且目的基因在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清显著降低大肠杆菌和副伤寒沙门菌存活率,对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较低。【结论】建立了稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,其表达产物对耐药大肠杆菌具有良好的抗菌效果,对推动防御素的应用提供技术支持。  相似文献   
2.
【目的】本研究构建禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC) yge G基因缺失株,并对其进行生物学特性及致病性分析,探究yge G在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究其所在的Ⅲ型分泌系统2 (type three secretion systems 2,ETT2)毒力岛的致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建yge G缺失株APEC81-Δyge G及其回复株APEC81-CΔyge G,通过运动性、生物被膜形成能力、抗逆性、抗血清杀菌能力等试验分析yge G对APEC致病性相关的生物学功能的影响,并通过细胞黏附、侵袭试验及荧光定量PCR检测细胞炎性因子转录水平探究yge G对APEC感染宿主过程的影响。【结果】成功构建了缺失株APEC81-Δyge G和回复株APEC81-CΔyge G;与野生株APEC81相比,缺失株APEC81-Δyge G生长特性无显著变化(P>0.05),生物被膜形成能力显著降低(P<0.01),运动能力极显著升高(P<0.001),对酸休克和氧化休克的耐受力极显...  相似文献   
3.
本研究以禽致病性大肠杆菌(APEC)及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡小肠为模型,以分析其免疫相关基因的表达变化为目的,采用转录组测序(RNA-Seq)技术对感染APEC及其PhoP/Q缺失株的雏鸡小肠样本RNA进行测序,分析免疫相关基因的表达变化,结果为野生株攻毒组与对照组相比、野生株攻毒组与缺失株攻毒组相比、缺失株攻毒组与对照组相比,分别筛选出131、105、172个差异表达基因(fold change≥2, FDR≤0.05),GO功能分类结果显示分别有87、99、159个基因得到注释,这些基因主要富集到氧化还原过程、脂蛋白转运、血管内皮细胞迁移、免疫反应、凋亡过程负调控、肝素结合、铁离子结合、CCR趋化因子受体结合等功能,得出APEC及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡后引起机体肠道免疫相关基因变化的结论,根据GO功能注释筛选出PTPRC、LCP1、YFV等免疫相关基因,为深入研究雏鸡肠道免疫提供依据。  相似文献   
4.
【目的】探究毒力基因ompA在禽致病性大肠埃希菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)分泌外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)诱导鸡气管黏膜上皮细胞(chicken trachea epithelium cells, CTECs)凋亡中的功能,为后期深入研究APEC-OMV的致病机制奠定基础。【方法】以APEC分离株AE17为野生株,利用CRISPR/Cas9系统构建ompA基因缺失株,利用表达载体pET-28a构建ompA基因过表达株,并分别提取野生株、缺失株、pET-28a空载株及过表达株的OMV。通过透射电镜、纳米颗粒分析、annexin V-FITC/PI双染检测及超微病理切片等实验探究毒力基因ompA在APEC-OMV诱导CTECs细胞凋亡中的功能。【结果】成功构建缺失株AE17ΔompA、空载株AE17-pET-28a及过表达株AE17-pET-28a-OmpA。与AE17的OMV(AE17-OMV)相比,AE17ΔompA的OMV(AE17ΔompA-OMV)颗粒浓度显著减少且平均粒径显著降低(P<...  相似文献   
5.
尹磊  祁克宗  宋祥军  涂健 《微生物学通报》2017,44(12):3031-3037
许多革兰氏阴性菌借助Ⅲ型分泌系统黏附在宿主细胞表面,然后跨越胞膜将特异性蛋白注入宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路,从而有利于细菌的感染及定殖。在肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)中,除了肠细胞脱落位点(Locus of entericyte effacement,LEE)毒力岛编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)外,在分析肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组序列时发现一个新的Ⅲ型分泌系统,大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(Escherichia coli type Ⅲ secretion system 2,ETT2)毒力岛。研究显示,ETT2可能在大多数菌株中不具有完整的分泌系统功能,但是其对于细菌毒力的发挥具有重要作用。因此,本文简要综述了大肠杆菌ETT2的基因特征、ETT2的分布与流行、ETT2的功能与机制等方面的主要研究进展。  相似文献   
6.
【目的】禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)不仅严重影响全球的养禽业,对人类公共健康也造成巨大的潜在威胁。pag P基因在细菌的抗菌肽抗性和致病性方面发挥重要作用,但关于pag P基因在APEC中的功能尚不清楚。本文构建禽致病性大肠杆菌pag P基因缺失株,对缺失株的抗菌肽抗性和致病性进行研究。【方法】利用Red重组系统构建APEC的pag P基因缺失株,然后利用回复质粒构建回复株。研究pag P基因对细胞黏附与入侵、生物被膜形成能力、外膜渗透性、抗菌肽敏感性、致病性等方面的影响。【结果】成功构建pag P基因缺失株和回复株,抗菌肽抗性试验发现pag P基因缺失株对多粘菌素B、鸡β-防御素2(AVBD2)的敏感性显著增加(P0.01),致病性试验结果表明pag P基因缺失株的毒力显著降低(P0.01)。【结论】APEC的pag P基因对AVBD2的敏感性和APEC的致病性密切相关,为深入研究pag P基因的功能及调控作用奠定了基础。  相似文献   
7.
【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是禽类主要病原菌之一,大肠杆菌三型分泌系统2 (Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)可通过转录调节子调控其致病性,但在APEC中转录调节子EtrA对其致病性的影响目前尚不清楚。【目的】研究ETT2中转录调节子EtrA对APEC致病性的影响。【方法】利用Red同源重组技术构建ETT2-etrA基因缺失株及回复株。比较生长性能、生物被膜形成、运动性及对血清敏感性的差异,基于RNA-Seq测序及Real-timePCR技术比较野生株和缺失株中与生物被膜形成、运动性以及毒力因子相关基因的转录水平。【结果】与野生株相比,缺失株及回复株生长特性无显著变化(P0.05),但APEC40-ΔetrA生物被膜形成能力和对血清敏感性明显增强(P0.001),运动性较野生株明显下降(P0.01),回复株的表型有所回复。转录组学筛选出7个毒力差异基因,生物被膜形成相关基因显著上调,参与影响细菌运动性的基因显著下调。qRT-PCR验证与转录组学结果一致。【结论】etrA缺失可以显著影响APEC的生物被膜形成、运动性及对血清的敏感性,这可为进一步探讨ETT2对APEC的致病作用提供参考。  相似文献   
8.
【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起禽类急性或亚急性感染,在近年新发现的大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2 (Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)中,毒力基因yqeH对其致病性的影响尚不明确。【目的】探究yqeH在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建yqeH缺失株ΔyqeH及其回复株CΔyqeH,通过运动性、生物被膜形成能力、抗逆性、抗血清杀菌能力等试验分析yqeH对APEC生物学功能的影响,并通过细胞黏附、侵袭试验、致病力测定及荧光定量PCR检测细胞炎性因子转录水平,探究yqeH对APEC感染宿主的影响。【结果】构建了缺失株ΔyqeH和回复株CΔyqeH;生物学特性试验结果表明,与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH生物被膜形成能力、运动能力降低,对酸、碱、渗透压、氧化休克的耐受力降低,抗血清杀菌能力及致病力显著降低;与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH对鸡气管黏膜上皮细胞的黏附及侵袭能...  相似文献   
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