Tc1/Mariner转座子超家族的研究进展

随着高通量测序技术的迅猛发展,越来越多的生物基因组注释结果表明：转座子几乎存在于所有生物的基因组中,是大多数生物基因组的重要组分。其中,Tc1/Mariner转座子是自然界中分布最广泛的一类DNA转座子超家族,在自然界已经发现14个有活性的Tc1/Mariner转座子(如Minos,Mos1等),另外通过分子重构也获得高活性的人工转座子,如睡美人转座子(Sleeping Beauty, SB)。SB和Mos1等转座子作为基因转移载体已被广泛应用于转基因、基因捕获和基因治疗等领域的研究中,并取得了很好的应用效果。本文将重点综述Tc1/Mariner转座子的结构、分类、分布、转座机制、活性转座子的挖掘,及其在转基因、基因捕获和基因治疗等研究领域的应用。     

斑马鱼转座子时空表达特性

转座子是基因组中可移动和扩展的元件,能够插入新的位点,影响基因组和基因的结构和功能,是基因组进化的内在驱动。为探讨转座子的时空表达特性,首先通过生物信息学方法鉴定出斑马鱼9个疑似活性转座子,包括DNA转座子Tc1家族(Tc-a、Tc-b、Tc-c、Tc-d、Tc-e)、反转录转座子ERV家族(ERV-1、ERV-2)和LINE家族(L1-323、L1-21),然后采用实时荧光定量PCR法检测上述转座子在斑马鱼早期胚胎发育7个阶段及成鱼各主要脏器的表达活性。结果表明:Tc1家族在0.75、2.00、3.00 h各阶段无转录活性,在6.00、15.00、24.00、48.00 h各阶段各转座子均有较高转录活性;反转录转座子转录活性最早出现于3 h,最晚出现于15 h,且随着发育时间的延长,转录活性显著增强。9种转座子在成鱼心脏、大脑、肌肉、肝脏、睾丸和卵巢均有表达,且大脑和心脏中的表达水平显著高于其他组织,睾丸表达水平最低。分析表明转座子的表达具有时间和组织的特异性,可能参与斑马鱼胚胎和组织器官发育调控,尤其是大脑和心脏发育。这些结果为进一步研究转座子是否具有基因表达调控功能提供重要参考。     

转座子引起的猪ktn1基因结构变异及其与生产性能的关联分析

为探明转座子对猪的ktn1基因及其侧翼区结构变异的贡献,从全基因组测序(WGS)数据库中获取14个猪基因组中的ktn1基因序列和侧翼序列,通过ClustalX多序列比对和RepeatMasker转座子注释,全面解析转座子对ktn1的影响。通过PCR检测到一个SINEA1转座子插入多态,在苏姜猪群体中与相关性状进行关联分析。结果显示,ktn1基因及其侧翼区中含有至少77个转座子片段,其中绝大部分(98.70%)为SINE类转座子,并鉴定到9个小结构变异和4个由转座子引起的大结构变异,表明转座子是基因变异的重要来源。其中一个SINEA1插入多态引起的结构变异,在不同品种中呈现丰富的多态性,且无插入个体(SINE-/-)苏姜猪的断奶窝重((64.20±10.6) kg)比纯合有插入个体(SINE+/+)((74.14±9.0) kg)和杂合有插入个体(SINE+/-)((69.71±7.7) kg)轻(P<0.05),表明基于转座子插入多态研发分子标记具有可行性,提示转座子插入多态分子标记在分子辅助育种中具有较强的应用潜力。     

猪POU1F1基因5’侧翼区克隆及序列分析

POU1F1基因是POU基因家族的成员之一,对哺乳动物的早期发育和相关基因启动表达起重要的调控作用。本文利用染色体步移技术,从长白猪基因组中首次克隆到了约1．5kb的POU1F1基因5’侧翼区序列,并利用相关软件对其进行了序列分析和物种间POU1F1基因5’侧翼区序列比对及进化树构建。结果表明所克隆的片段中含典型的TATA盒（-57）和类CAAT盒序列（-87）。TESS软件分析发现在启动子附近有一系列潜在的重要的转录因子结合位点。序列比对结果表明不同物种POU1F1基因的转录起始点上游-150bp区域保守性较强,可能是启动子的核心序列。其中猪与牛的同源性最高,其次是黑猩猩、人、狗,与大鼠、小鼠和鸡同源性较低,与斑马鱼序列同源性最低。同源序列主要集中在转录起始点上游-150bp至-1000bp区域。Vista中的MLAGAN程序构建的系统进化树真实反应了物种间进化关系。     

猪GH基因部分突变位点对生产性能的影响

本试验利用PCR－RFLPs技术,用MspⅠ,ApaⅠ两种限制酶,检测了猪生长激素基因＋206－＋711位共506bp片段中[ 295- 300, 563- 566]2处突变位点,分析各多态位点在姜曲海猪中的分布及其与生产性能的关系。发现：姜曲海猪中,MspⅠ酶切突变位点中的G1G2基因型和G2G2基因基因型个体的生产性能没有差异,不同日龄体重在两组间变化没有规律。ApaⅠ酶切突变位点G4G4基因型个体的20个日龄体重、45日龄体重高于G3G3／G3G4基因型个体,但差异不显。G4G4基因型个体的70日龄体重极显高于G3G3／G3G4基因型个体（P＜0．01）。G4G4基因型个体的0－70日龄日增重也极显高于G3G3／G3G4基因型个体（P＜0．01）。这些结果显示GH基因有可能作为数量性状基因座的侯选基因。     

"睡美人"转座子的研究进展

“睡美人( Sleeping Beauty, SB) ”转座系统是Tc1/mariner 转座子超家族中的一员,已经失活了一千多万年。1997年,Ivics 等根据积累的系统发生数据,利用生物信息学的方法, 对其进行分子重建, 终于唤醒了其转座活性。近年来对“睡美人”转座系统的转座效率和转座机理进行的研究,已证明SB转座子在基因筛选,转基因及基因治疗等领域具有广阔的应用前景。文章重点论述了SB转座子在结构及其优化、转座机制和应用等方面的进展,同时对其研究中出现的各种问题进行了总结并提出了一些解决方案。     

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达, 并简化质粒DNA的制备过程, 本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造, 为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5￠-和3￠-调控区切出, 同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体, 构建成另一输卵管特异表达载体pOV2; 将鸡卵清蛋白基因5￠-调控区单独克隆入同样载体, 获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性, 将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5'-调控区的下游, 获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后, 经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测, 结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达, 而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达, 而且表达的重组酶能分泌到蛋清中, 雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用, 其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明, 鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点, 能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

鸡Mx蛋白基因诱变修饰及抗病活性

[目的]进一步研究鸡Mx蛋白第631位氨基酸的变异与鸡群抗病性的相关性.[方法]本实验利用PCR突变技术将鸡Mx蛋白基因的全长cDNA第2032位的碱基由G突变为A(既631位氨基酸的改变),并将突变的Mx基因插入真核表达载体pcDNA3.0,重组表达载体转染COS-Ⅰ细胞后,进行RT-PCR与间接免疫荧光(IFA)鉴定.[结果]对鸡Mx蛋白基因的cDNA进行PCR诱变修饰正确,构建了能够正确表达鸡Mx蛋白的重组真核表达载体;诱变修饰重组Mx蛋白对抗新城疫病毒(NDV)感染分析结果显示,重组Mx蛋白具有较强的抗新城疫病毒生物活性.[结论]为下一步研究鸡Mx蛋白的抗病机理与制备抗病转基因鸡奠定了坚实的基础.     

猪POU1F1基因部分序列变异和同源性分析

对长白、杜洛克、约克夏、姜曲海、梅山和香猪等六个猪种的POU1F1基因第四、第五和第六外显子分别进行PCR扩增,并对含有第四、第六外显子的PCR产物和含有第五外显子的克隆产物进行测序。结果表明：六个猪种中,POU1F1基因的第四外显子存在碱基突变,为T→C。对该序列进行Nla Ⅲ 酶消化,产生两种不同的基因型(GG和HH);而第五和第六外显子则高度保守,未发现任何突变。将人POU1F1基因第四外显子、POU同源区核苷酸编码序列和氨基酸序列,分别与猪、小鼠、牛的POU1F1基因相应的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较,结果发现：人与猪、小鼠、牛的POU1F1基因第四外显子的核苷酸同源性分别高达93.9%、86.7%、92.1%,而由第四外显子编码的部分POU特异区的氨基酸序列则完全一致;人与猪、小鼠、牛POU同源区的核苷酸同源性分别为91.4%、85.1%、87.9%,氨基酸同源性分别为96.6%、94.8%、90.2%。这说明在哺乳动物中,其POU1F1蛋白的POU同源区和由第四外显子编码的POU特异区部分是高度保守的;猪可作为实验动物,建立人类相关疾病模型,为医学研究提供参考依据。     

猪esr基因反转录转座子插入多态性及其与大白猪生产性能的关联性分析

雌激素受体 (Estrogen receptor,esr) 介导雌激素影响相关基因表达,从而调控哺乳动物的生长和繁殖机能。为了探讨esr基因的反转录转座子多态性对猪生长性能的影响,文中应用比较基因组学和生物信息学方法,预测猪esr基因的反转录转座子插入位点,采用PCR方法验证不同品种猪中插入多态性,并将该基因型与大白猪性能进行关联分析。结果显示,esr1和esr2基因验证后得到4个反转录转座子多态性位点,分别是位于esr1基因内含子2的esr1-SINE-RIP1、位于内含子5的esr1-LINE-RIP2和esr1-SINE-RIP3,以及位于esr2基因内含子1的esr2-LINE-RIP。其中esr1-SINE-RIP1的287 bp SINE插入对大白猪的活体背膘厚和100 kg体重背膘厚有显著影响 (P<0.05) ,纯合有插入 (SINE+/+) 的活体背膘厚和100 kg体重背膘厚显著高于杂合有插入 (SINE+/-) 和无插入 (SINE-/-) 型。这表明esr1-SINE-RIP1位点可作为分子标记辅助选育大白猪的背膘厚性状。