运用CRISPR/Cas系统敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其对脂肪酸代谢的影响

【目的】CRISPR/Cas是目前基因编辑的一个重要的新兴技术,拟通过该技术,对大肠杆菌进行快速、高效的基因编辑,获取脂肪酸代谢工程菌。【方法】利用一个二元载体构建出CRISPR/Cas偶联λ-Red重组酶的系统,重叠PCR扩增出敲除的Donor,最后用电转的方式对Escherichia coli MG1655脂肪酸代谢相关基因进行快速编辑。同时,采用气相色谱-质谱(GC-MS)对脂肪酸进行定性及定量分析。【结果】获得了大肠杆菌ΔPEPC(partial)、ΔPEPC、ΔPEPC(partial)-ΔFad D、ΔPEPC-ΔFad D以及ΔFad D突变体菌株。各缺失体菌株脂肪酸含量均比野生型要高,最高的增长了3.7%,但是敲除ppc获得的脂肪酸增长量并没有预期的高。同时在脂肪酸组成上,各菌株均含有11:0、12:0、13:0、14:0、15:0、16:0、17:1、17:0、18:0,并且16:0,17:0,18:0占主要组成部分。【结论】运用该技术可以快速、高效地对大肠杆菌基因进行编辑,是大肠杆菌工程菌株构建的一个新思路,对其他工程菌的构建提供了一定的理论基础。