长双歧杆菌NCC2705葡萄糖与果糖代谢的比较蛋白质组学

为揭示长双歧杆菌NCC2705 (Bifidobacterium longum NCC2705)果糖代谢途径, 建立其果糖发酵模型。以本实验室前期构建的长双歧杆菌NCC2705菌株蛋白质参考图谱为基础, 进行了果糖和葡萄糖生长的菌体比较蛋白质组学研究, 利用MALDI-TOF和ESI-MS/MS鉴定差异蛋白, 进一步通过半定量RT-PCR验证二者显著差异表达蛋白。果糖生长的菌体蛋白中鉴定到了所有葡萄糖降解途径中的酶和蛋白质, 另外鉴定到3倍以上差异蛋白点9个, 其对应的5个蛋白在果糖发酵中上调。半定量RT-PCR验证显著差异蛋白, 显示在果糖发酵中具有高水平表达是ABC 转运系统的果糖特异性-结合蛋白BL0033和ATP结合蛋白BL0034。果糖的发酵时间和浓度梯度试验显示诱导时间越长、浓度越高, BL0033的表达量越高。第一, 比较蛋白谱证明果糖和葡萄糖以相同途径降解。第二, BL0033的表达是受果糖诱导的, 果糖的吸收可能是通过一个特殊的转运系统, 即ABC转运系统将果糖从胞外转运到胞内, 其中BL0033和BL0034共同作为系统元件扮演了重要角色。     

NOD1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建天然免疫胞内识别受体核苷酸寡聚域1(NOD1)真核表达质粒。方法:NOD1基因片段经PCR扩增获得,经酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,对挑选出的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒pflag-NOD1转染293T细胞,用Western印迹检测目的蛋白的表达,同时用NF-κB的萤光素酶报告基因检测NOD1蛋白的活性。结果:pflag-NOD1可以在真核细胞293T中表达,并可以增强NF-κB报告基因的转录活性。结论:构建了重组质粒pflag-NOD1,在细胞中表达NOD1后能够提高NF-κB转录的生物活性,为进一步研究NOD1的功能奠定了基础。     

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测副溶血性弧菌

利用DNA环介导恒温核酸扩增法（LAMP）针对副溶血性弧菌特异基因tlh基因设计4条引物,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域来快速检测副溶血性弧菌.LAMP反应的过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁,故可以通过监测浊度来判定反应结果.实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在60～65℃恒温条件下50min内完成;如果在反应前添加羟基萘酚兰（HNB）,蓝色的阳性结果很明显区别于紫色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为9.74pg/μL,PCR方法最低检出限为97.4pg/μL,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,且具有良好的特异性.LAMP方法用于快速检测副溶血性弧菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,所以LAMP方法检测副溶血性弧菌特别适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断.     

长双歧杆菌NCC2705群体感应系统信号分子AI-2的检测

目的:用生物学方法检测长双歧杆菌NCC2705是否产生群体感应系统信号分子AI-2。方法:将长双歧杆菌NCC2705不同时间点的培养上清分别加至AI-2特异报告系统哈氏弧菌BB170中,以空白培养基上清为对照,用荧光光度计对哈氏弧菌发光强度进行计量,推测出长双歧杆菌NCC2705上清中是否含有分泌的AI-2,并由此推断AI-2的活性。结果:通过微孔板检测系统对加入长双歧杆菌NCC2705培养上清的哈氏弧菌BB170进行检测,发现双歧杆菌上清的加入增强了哈氏弧菌BB170发出的荧光强度。结论:长双歧杆菌NCC2705中存在依赖于luxS/AI-2的群体感应系统,并能够分泌有活性的AI-2,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705AI-2及luxS基因的功能打下基础。     

蛋白质磷酸化修饰的研究进展

蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,它参与和调控生物体内的许多生命活动。通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化,调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。随着蛋白质组学技术的发展和应用,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。我们介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备、磷酸化蛋白的鉴定及磷酸化位点的预测、蛋白分离后磷酸化蛋白的检测,及蛋白质磷酸化的分子机制,并综述了近年来国内外的主要相关研究进展。     

志贺氏菌福氏2a 301株ipaH4.5突变株的构建及生物学功能分析

利用λ-Red重组系统对福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因缺失突变株?ipaH4.5,利用低拷贝质粒构建ipaH4.5缺失突变株的回复突变株△ipaH4.5HF。PCR方法证实了ipaH4.5基因的缺失和回复。对野生株、突变株和回复突变株的生长代谢及细胞侵袭能力进行比较;ELISA方法检测3株菌侵袭鼠J774巨噬细胞后培养上清中炎性因子的水平。生长代谢实验表明缺失和回复ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长速度,侵袭实验表明缺失和回复ipaH4.5也不影响志贺氏菌对HeLa细胞和鼠J774巨噬细胞的侵袭能力,表明ipaH4.5基因与志贺氏菌的生长代谢和侵袭能力无关;鼠J774巨噬细胞培养上清中细胞因子水平的改变提示该基因在志贺氏菌侵入细胞后抑制宿主细胞炎症反应。     

长双歧杆菌NCC2705葡萄糖与乳糖代谢的比较蛋白质组学

[目的]以本实验室前期构建的长双歧杆菌NCC2705菌株蛋白质参考图谱为基础,研究长双歧杆菌发酵乳糖和葡萄糖的比较蛋白质组学.[方法]采用ImageMaster 2D Elite Platnum Version 5.0比较分析3倍以上蛋白差异点;利用MALDI-TOF进行差异蛋白鉴定,每个蛋白质点的肽指纹图谱在长双歧杆菌NCC2705菌株的蛋白质数据库用Mascot进行检索;采用Pro-Q磷酸化试剂进行磷酸化蛋白的染色.[结果]鉴定到31个蛋白表达发生显著变化,在乳糖发酵中14个蛋白上调17个蛋白下调.这些蛋白为亲水性酸性蛋白,它们基因的CAI值均在0.5以上,主要包括糖代谢相关蛋白、应激蛋白、转录和翻译相关蛋白,还有一些未知功能的蛋白.此外,有两个蛋白:转醛缩酶(BL0715,transaldolase,tal)L3蛋白点和丙酮酸激酶(BL0988,pyruvate kinase,pyk)G9蛋白点发生了磷酸化作用.[结论]长双歧杆菌NCC2705在乳糖中生长快于葡萄糖,它们的降解途径是相同的;转醛缩酶和丙酮酸激酶发生了翻译后修饰作用,推测转醛缩酶在43T和47S发生了磷酸化,而丙酮酸激酶在65S发生了磷酸化.