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1.
为了获得优化的猪乳铁蛋白乳杆菌表达系统,并比较重组猪乳铁蛋白的抑菌活性,根据乳杆菌使用密码子的偏嗜性优化合成猪乳铁蛋白成熟肽编码序列,将其克隆到乳杆菌表达载体pPG612.1的XhoⅠ/BamHⅠ位点,获得了plf乳杆菌表达载体质粒pPG612.1-plf。将获得的重组质粒分别电转化入干酪乳杆菌ATCC393、戊糖乳杆菌KLDS1.0413、植物乳杆菌KLDS1.0344和副干酪乳杆菌KLDS1.0652细胞内,获得4种表达猪乳铁蛋白的重组乳杆菌。经木糖诱导,通过Western blotting和激光共聚焦检测重组猪乳铁蛋白的表达,用ELISA方法检测和比较4种重组菌上清中表达猪乳铁蛋白的量,并用琼脂孔穴扩散抑菌法检测4种重组乳杆菌表达乳铁蛋白的抑菌活性。结果表明,乳铁蛋白在4种重组乳杆菌中均得到正确表达,其产物分子量约73 kDa,重组干酪乳杆菌、重组戊糖乳杆菌、重组植物乳杆菌和重组副干酪乳杆菌的重组猪乳铁蛋白表达量分别为9.6μg/mL、10.8μg/mL、12.5μg/mL、9.9μg/mL。重组猪乳铁蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、巴氏杆菌和李氏杆菌均有一定的抑菌作用,对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强,且4种重组乳杆菌中重组植物乳杆菌表达产物的抑菌效果优于其他重组菌的表达产物。结果表明在4种乳杆菌中重组猪乳铁蛋白的最佳表达系统为植物乳杆菌,该结果为猪乳铁蛋白的乳杆菌表达系统进一步开发与应用奠定了基础。  相似文献   
2.
为探讨表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白(N)基因的重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠后诱导特异性免疫应答,本研究制备表达流行性腹泻病毒核蛋白的重组干酪乳杆菌,应用Western blotting、间接免疫荧光和全细胞ELISA鉴定目的蛋白的表达。然后用该重组干酪乳杆菌口服免疫BALB/c小鼠,分别测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性;并测定免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和细胞因子水平。结果显示,目的蛋白表达在细胞表面,可被阳性血清所识别。免疫小鼠后,可分别在血清中和粪便中检测到较高水平特异性IgG、sIgA(P<0.01),但血清并没有中和活性;淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定结果显示,免疫组可产生明显的细胞免疫应答。结果表明,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生黏膜免疫应答和系统免疫应答,具有作为口服疫苗潜在的应用价值。  相似文献   
3.
为了在乳酸乳球菌中分泌表达具有生物活性的猪IL-18蛋白,并检测其生物活性,故通过分离猪外周血单核淋巴细胞(PBMC),以其为模板,采用RT-PCR方法扩增猪白细胞介素18(pIL-18)基因,将目的基因与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,通过SDS-PAGE和Western blotting分析检测目的蛋白的表达,并通过脾淋巴细胞增殖试验和细胞病变抑制法对pIL-18的生物活性进行检测。Western blotting分析检测结果与生物活性检测结果显示,在重组菌pAMJ399-pIL18/MG1363的上清和菌体沉淀中19 kDa处均出现pIL-18的特异蛋白反应带,且分泌表达的pIL-18蛋白能明显促进猪脾淋巴细胞的增殖,并对病毒增殖有明显的抑制作用。以上结果表明pIL-18可在乳酸乳球菌分泌表达,且表达产物具有良好的生物活性。  相似文献   
4.
目的:构建猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的细胞内表达重组乳酸乳球菌,确定其最佳表达条件,为重组乳酸菌作为口服疫苗防治猪传染性胃肠炎奠定基础。方法:根据猪传染性胃肠炎病毒纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR,获得含有TGEV S基因4个主要抗原位点的约2000bp目的片段,将其与表达载体质粒pNZ8048进行连接,通过电转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,在乳链菌肽(Nisin)的诱导下进行表达,确定最佳表达条件;并通过SDS-PAGE进行检测和Western-blot分析表达蛋白活性。结果:成功获得了TGEV S蛋白在乳酸乳球菌细胞内的表达并且表达的蛋白具有TGE全病毒的抗原性。确定了乳酸乳球菌表达TGEV S蛋白的最佳表达条件为在以1ng/ml的乳链杆菌肽nisin诱导下,诱导后3h,重组蛋白表达效率达最高,重组蛋白约占菌体总蛋白含量的8.7%。结论:在乳酸乳球菌细胞内表达的重组TGEV S蛋白获得了理想表达,为进一步研制开发防治TGE口服疫苗提供物质基础。  相似文献   
5.
重组干酪乳杆菌在模拟消化环境中生存性能的研究   总被引:6,自引:0,他引:6  
目的 探讨重组干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393在模拟胃肠道环境中的存活能力.方法 人工模拟胃肠道环境,即人工胃液(pH=1.5~4.5)、人工肠液、胆汁(质量浓度0.3~3.0 g/L)和高盐(质量浓度40~90g/L).结果 重组干酪乳杆菌在pH为2.5~4.5的人工胃液中具有较强的生存能力,3 h活菌数仍达108/ml;在人工肠液中经过不同时间的作用后,重组干酪乳杆菌显出生长趋势;在0.3%的胆汁环境作用8 h仍有存活,且能耐受7%NaCl浓度的高渗环境.结论 实验为干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393能否作为益生菌制剂在胃肠道中发挥作用提供了理论基础.  相似文献   
6.
根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888—27184)区的反义RNA序列。将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN—N5’,并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg/ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆。取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞。提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT_PCR证明PL,XSN—N5’整合到IBRS2细胞基因组。病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用。  相似文献   
7.
猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌表面的表达   总被引:3,自引:0,他引:3  
将编码猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,SDS-PAGE检测表明,有约74kD蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western-blot结果分析表明,表达的蛋白可被鼠源PPV抗血清所识别,间接免疫荧光实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到。  相似文献   
8.
根据猪传染性胃肠炎病毒纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR扩增,获得含有TGEVS基因4个主要抗原位点的约2000bp的目的片段,将其与分泌表达的载体质粒pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,在乳链菌肽(Nisin)的诱导下进行表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,表明TGEVS蛋白在乳酸乳球菌中获得表达,所表达的TGEVS蛋白具有与TGE病毒一样的抗原特异性。间接免疫荧光试验表明重组菌表达蛋白定位于菌体表面。将表达TGEVS蛋白的重组乳酸乳球菌及空质粒菌株分别口服免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品进行抗体检测,结果表明分泌型的重组菌pNZ8112-Sa/NZ9000免疫小鼠能够产生明显的抗TGEVsIgA抗体。  相似文献   
9.
牛乳铁蛋白肽是由牛乳铁蛋白经消化酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的短肽;乳酸乳球菌作为食品级微生物,既有天然的益生作用,又是理想的表达牛乳铁蛋白肽的载体。【目的】探究重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363表达牛乳铁蛋白肽的抑菌活性。【方法】利用牛乳铁蛋白肽标准品绘制定量标准曲线来确定重组牛乳铁蛋白肽的含量,利用牛津杯法及微量肉汤稀释法测定重组牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等35株细菌的抑菌活性及最小抑菌浓度,利用扫描电镜、透射电镜、荧光显微镜、凝胶阻滞试验、黏附试验来探究重组牛乳铁蛋白肽对菌体结构、细菌DNA及黏附力的影响,利用CCK-8检测其对RAW 264.7细胞的毒性作用,并对小鼠红细胞溶血率进行测定。【结果】重组乳酸乳球菌上清中牛乳铁蛋白肽的浓度为24.39μg/mL,重组牛乳铁蛋白肽对测试的25株致病菌均有不同程度的抑制作用,抑菌浓度范围在16–128μg/mL,但对9株乳酸菌以及粪肠球菌没有明显的抑制作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门菌的菌体完整性具有不同程度的破坏作用,其主要作用靶点为细菌的细胞膜,可以与细菌DNA结合并抑制细菌对Caco-2、IPEC细胞的黏附作用,重组牛乳铁蛋白肽对小鼠红细胞及RAW 264.7细胞没有明显的细胞毒性。【结论】乳酸乳球菌表达重组牛乳铁蛋白肽的抑菌活性与牛乳铁蛋白肽标准品相一致,通过直接作用于细菌细胞膜、胞内核酸或抑制细菌对正常细胞的黏附作用等多方面实现抑制或杀死细菌,发挥广谱的抗菌活性,且对真核细胞没有明显的细胞毒性作用。  相似文献   
10.
蓝舌病病毒4型特异性竞争ELISA检测方法的建立   总被引:2,自引:0,他引:2  
旨在建立蓝舌病病毒4型(BTV-4)特异性抗体ELISA检测方法,为蓝舌病的免疫学诊断提供新的技术。利用制备的两株抗4型BTV VP2蛋白的单克隆抗体4A-1G7和4B-1B6,建立BTV-4特异性竞争ELISA抗体检测方法。利用该方法同时对50份羊和牛BTV阴性血清进行检测,分别确定两种方法阻断率临界值为49%和40%。利用标准阳性血清检测的试验结果表明,该方法的敏感性、特异性和重复性符合OIE通用标准。同时,4A-1G7和4B-1B6两种竞争ELISA方法联合作用,可以检测感染4、18和20型BTV的血清。研究结果为建立以上各型BTV的检测方法提供了基础。  相似文献   
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